Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione
Summary
Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l’isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.
Abstract
In questo articolo, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l’isolamento di singole cellule atriali cardiomiociti (ACMs) da un modello del ratto della sindrome metabolica (MetS)-correlate a insufficienza cardiaca con frazione di eiezione preservata (HFpEF). La prevalenza di MetS-correlati HFpEF è in aumento, e malattie del miocardio atriale associati rimodellamento atriale e fibrillazione atriale sono clinicamente altamente rilevanti come rimodellamento atriale è un preannunciatore indipendente della mortalità. Studi con cardiomiociti isolati unicellulare utilizzati frequentemente per corroborare e integrare i risultati in vivo . Rarefication vaso circolatorio e fibrosi del tessuto interstiziale rappresentano un fattore potenzialmente limitante per l’isolamento di singole cellule successo di ACMs da modelli animali di questa malattia.
Abbiamo affrontato questo problema con l’ausilio di un dispositivo in grado di regolare manualmente la pressione intraluminale delle cavità cardiache durante la procedura di isolamento, sostanzialmente aumentando il rendimento della ACMs morfologicamente e funzionalmente intatto. Le cellule acquisite possono essere utilizzate in una varietà di diversi esperimenti, come coltura cellulare e formazione immagine funzionale del calcio (cioè, accoppiamento eccitazione-contrazione).
Forniamo il ricercatore con un protocollo passo dopo passo, un elenco di soluzioni ottimizzate, approfondite istruzioni per preparare l’attrezzatura necessaria e una completa guida sulla risoluzione dei problemi. Mentre l’implementazione iniziale della procedura potrebbe essere piuttosto difficile, un efficace adattamento permetterà al lettore di eseguire isolamenti di ACM di state-of-the-art in un modello del ratto di MetS-relative HFpEF per un ampio spettro di esperimenti.
Introduction
MetS descrive un cluster di fattori di rischio per diabete mellito tipo 2 e malattie cardiovascolari e include un aumento della pressione sanguigna arteriosa, dislipidemia (trigliceridi di sollevato e abbassato il colesterolo della lipoproteina ad alta densità), aumentato il digiuno glucosio e l’obesità centrale1. La prevalenza in tutto il mondo dei MetS è stimata essere di 25 – 30% e costantemente aumentante2. HFpEF è una sindrome clinica eterogenea, spesso associata a MetS. Il rimodellamento cardiaco durante HFpEF e le sue fasi precedenti (cioè, cardiopatia ipertensiva) è accompagnato anche da un rimodellamento del atria3. Riduzione della funzione contrattile e cambiamenti strutturali dell’atrio sinistro sono stati associati con la mortalità aumentata, fibrillazione atriale e scompenso cardiaco di nuova insorgenza4. Rimodellamento atriale è caratterizzata da cambiamenti nella funzione dei canali ionici, omeostasi del Ca2 + , struttura atriale, l’attivazione dei fibroblasti e dei tessuti fibrosi5. Lasciato il rimodellamento atriale in MetS-correlati HFpEF e suoi sottostanti meccanismi patologici sono ancora poco conosciuti e richiedono un ulteriore approfondimento. Modelli animali hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso e portare a molti progressi nel campo delle malattie del miocardio atriale6,7,8,9.
Studi con cardiomiociti isolati unicellulare utilizzati frequentemente per corroborare e integrare i risultati in vivo . Un isolamento e coltura delle cellule successive potenziali, consentire per l’indagine su segnalazione di percorsi, canali ionici correnti e accoppiamento eccitazione-contrazione. In condizioni fisiologiche, cardiomiociti non proliferano. La fusione tra le sequenze regolatrici trascrizionale di un fattore natriuretico atriale e un virus simian 40 grande T antigene in topi transgenici hanno portato alla creazione del primo ACMs immortalizzate, denominata AT-110. L’ulteriore sviluppo delle cellule AT-1 ha dato origine alle cellule HL-1, che non possono solo essere attraversate in serie ma anche contraggono spontaneamente11. Esse, tuttavia, mostrano differenze strutturali e funzionali rispetto alle cellule di recente isolate, come un’ultrastruttura meno organizzata, un alto avvenimento di sviluppare miofibrille11e un hyperpolarization-attivato verso l’interno corrente12. L’isolamento dei cardiomyocytes ventricolari (VCM) nei ratti e nei topi da una varietà di modelli è affermata13,14,15,16,17,18 , 19. in generale, il cuore asportata è montato un apparato di Langendorff e retrogradely irrorato con Ca2 +-buffer liberi contenenti enzimi digestivi, come collagenasi e proteasi. Calcio è poi reintrodotto in un modo graduale alle condizioni fisiologiche. Tuttavia, anche se dedicati all’isolamento della ACMs i protocolli sono disponibili20,21, a causa di una maggiore fibrosi e differenze di pressione-related, loro utilità nei modelli di malattia con rimodellamento atriale è limitato.
In questo articolo, abbiamo implementato un protocollo per l’isolamento di atriali unicellulare cardiomiociti da animali che mostrano atriale che ritocca (cioè, in particolare per il modello di ratto ZFS1 per MetS-correlati HFpEF)22. Esistenti protocolli di isolamento sono stati ottimizzati e completati da un dispositivo semplice, su misura per controllare e modificare la pressione intraluminale delle cavità cardiache, portando a rendimenti più elevati di cardiomiociti morfologicamente e funzionalmente intatti. Il seguente protocollo fornisce il ricercatore con una guida dettagliata, una descrizione dettagliata dell’apparecchiatura su misura, un elenco di soluzioni, come pure una guida completa alla risoluzione dei problemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto prima un protocollo per l’isolamento di singole cellule ACMs da un modello del ratto di MetS-correlati HFpEF che mostra contrassegnato rimodellamento atriale22. La procedura è in modo univoco impegnativa come eccessivo tessuto adiposo può rendere la preparazione chirurgica, nonché l’inserimento di una canula dell’aorta, sempre più difficile. La guida alla risoluzione forniti in tabella 2 indirizzi i problemi più comuni della procedura di isolamento.
…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da DZHK (centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, D.B.), EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) e da BMBF (Ministero tedesco dell’istruzione e della ricerca), così come la Bosnia-Erzegovina-Charité scienziato clinico programma finanziato della Charité – Universitätsmedizin Berlin e Berlin Institute of Health (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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