यहाँ, हम का वर्णन एक अनुकूलित, Langendorff-आधारित प्रक्रिया एकल सेल अलिंद cardiomyocytes के एक चूहे के मॉडल से चयापचय सिंड्रोम के साथ संबंधित दिल की विफलता संरक्षित बेदखली अंश के साथ. हृदय गुहाओं के intraluminal दबाव के एक मैनुअल विनियमन कार्यात्मक बरकरार myocytes उत्तेजना-संकुचन-युग्मन अध्ययन के लिए उपयुक्त उपज के लिए लागू किया जाता है ।
इस अनुच्छेद में, हम एक अनुकूलित, Langendorff-आधारित प्रक्रिया के अलगाव के लिए एकल सेल अलिंद cardiomyocytes (ACMs) चयापचय सिंड्रोम (मेट्स) के एक चूहे के मॉडल से-संरक्षित इंजेक्शन अंश (HFpEF) के साथ संबंधित दिल की विफलता का वर्णन । मेट्स से संबंधित HFpEF की व्यापकता बढ़ रही है, और अलिंद remodeling और अलिंद अलिंद के साथ जुड़े अलिंद cardiomyopathies चिकित्सकीय बेहद प्रासंगिक है के रूप में अलिंद remodeling मृत्यु दर का एक स्वतंत्र कारक है । पृथक एकल सेल cardiomyocytes के साथ अध्ययन अक्सर पुष्ट और vivo निष्कर्षों में पूरक करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । संचार पोत rarefication और मध्य ऊतक फाइब्रोसिस इस रोग के पशु मॉडलों से ACMs के सफल एकल सेल अलगाव के लिए एक संभावित सीमित कारक मुद्रा ।
हम एक डिवाइस मैंयुअल रूप से अलगाव की प्रक्रिया के दौरान हृदय गुहाओं के intraluminal दबाव को विनियमित करने में सक्षम है, काफी आकृति विज्ञान की उपज में वृद्धि और कार्यात्मक बरकरार ACMs को रोजगार के द्वारा इस मुद्दे को संबोधित किया है । प्राप्त कोशिकाओं को विभिन्न प्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कोशिका संस्कृति और कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग (यानी, उत्तेजना-संकुचन-युग्मन).
हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल, अनुकूलित समाधान की एक सूची, आवश्यक उपकरण तैयार करने के लिए पूरी तरह से निर्देश, और एक व्यापक समस्या निवारण गाइड के साथ शोधकर्ता प्रदान करते हैं । हालांकि प्रक्रिया के प्रारंभिक कार्यांवयन के बजाय मुश्किल हो सकता है, एक सफल अनुकूलन पाठक राज्य के-the-कला ACM अलगाव मेट्स के एक चूहे के मॉडल में प्रदर्शन करने की अनुमति होगी प्रयोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए HFpEF संबंधित ।
मेट्स मधुमेह प्रकार के लिए जोखिम कारकों में से एक क्लस्टर का वर्णन-2 और हृदय रोग और एक वृद्धि हुई धमनी रक्तचाप भी शामिल है, डिसलिपिडेमिया (ट्राइग्लिसराइड्स उठाया और उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन कोलेस्ट्रॉल कम), उपवास बढ़ा ग्लूकोज, और मध्य मोटापा1. मेट्स के विश्वव्यापी प्रसार के लिए 25-30% और लगातार2बढ़ती अनुमानित है । HFpEF एक heterogenous नैदानिक सिंड्रोम अक्सर मेट्स के साथ जुड़ा हुआ है । HFpEF और उसके पूर्ववर्ती चरणों (यानी, ग्रस्त हृदय रोग) के दौरान कार्डियक remodeling भी atria3के एक remodeling के साथ है । कम सिकुड़ा समारोह और वाम atrium के संरचनात्मक परिवर्तन वृद्धि हुई मृत्यु दर, अलिंद अलिंद, और नई शुरुआत दिल असफलता4के साथ जुड़े रहे हैं । अलिंद remodeling आयन चैनल समारोह में परिवर्तन की विशेषता है, Ca2 + homeostasis, अलिंद संरचना, fibroblast सक्रियण, और ऊतक फाइब्रोसिस5. मेट्स-संबंधित HFpEF और उसके अंतर्निहित रोग तंत्र में अलिंद remodeling वाम अभी भी खराब समझ रहे है और एक और गहराई से जांच की आवश्यकता होती है । पशु मॉडल के लिए एक मूल्यवान उपकरण साबित हो गया है और अलिंद cardiomyopathies6,7,8,9के क्षेत्र में कई अग्रिमों के लिए नेतृत्व ।
पृथक एकल सेल cardiomyocytes के साथ अध्ययन अक्सर पुष्ट और vivo निष्कर्षों में पूरक करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । एक अलगाव, और संभावित बाद सेल संस्कृति, संकेत रास्ते की जांच के लिए अनुमति, ईओण चैनल धाराओं, और उत्तेजना-संकुचन-युग्मन । शारीरिक शर्तों के तहत, cardiomyocytes मत पैदा करना । एक अलिंद natriuretic कारक के transcriptional विनियामक अनुक्रम और ट्रांसजेनिक चूहों में एक simian वायरस ४० बड़े टी प्रतिजन के बीच फ्यूजन पहली अमर ACMs के निर्माण के लिए नेतृत्व किया, पर-110नाम. एटी-१ कोशिकाओं के आगे विकास ने एचएल-१ की कोशिकाओं को जन्म दिया, जो केवल प्रश्नपत्र ही नहीं हो सकता लेकिन यह भी अनुबंध अनायास11. वे करते हैं, तथापि, इस तरह के एक कम संगठित ultrastructure, myofibrils11के विकास की एक उच्च घटना के रूप में ताजा अलग कोशिकाओं की तुलना में संरचनात्मक और कार्यात्मक मतभेदों को दिखाने के लिए, और एक hyperpolarization आवक वर्तमान12सक्रिय । एक किस्म के मॉडलों से चूहों और चूहों में वेंट्रिकुलर cardiomyocytes (VCM) का अलगाव अच्छी तरह से स्थापित है13,14,15,16,17,18 , 19. आम तौर पर, आबकारी दिल एक Langendorff तंत्र के लिए मुहिम शुरू की है और एक Ca2 +मुक्त बफर जैसे collagenases और teases के रूप में पाचन एंजाइमों, युक्त के साथ प्रतिगामी perfused । कैल्शियम तो शारीरिक स्थितियों के लिए एक stepwise तरीके से फिर से शुरू है । हालांकि, भले ही ACMs के अलगाव के लिए समर्पित प्रोटोकॉल उपलब्ध है20,21, वृद्धि की फाइब्रोसिस और दबाव से संबंधित मतभेदों के कारण, अलिंद remodeling के साथ रोग मॉडल में उनकी उपयोगिता सीमित है ।
इस अनुच्छेद में, हम अलिंद एकल के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल लागू किया है-सेल cardiomyocytes जानवरों से है कि दिखाने के अलिंद remodeling (यानी, विशेष रूप से मेट्स के लिए ZFS1 चूहा मॉडल के लिए HFpEF से संबंधित)22। मौजूदा अलगाव प्रोटोकॉल को अनुकूलित और हृदय गुहाओं के intraluminal दबाव को नियंत्रित करने और संशोधित करने के लिए एक सरल, कस्टम-मेड डिवाइस द्वारा पूरित किया गया, आकृति विज्ञान की उच्च पैदावार और कार्यात्मक बरकरार cardiomyocytes के लिए अग्रणी । निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक कदम दर कदम गाइड के साथ शोधकर्ता प्रदान करता है, कस्टम-निर्मित उपकरण, समाधान की एक सूची, साथ ही एक व्यापक समस्या निवारण गाइड का एक विस्तृत विवरण.
यहां, हम पहले एकल सेल ACMs के अलगाव के लिए एक मेट्स के एक चूहे मॉडल से संबंधित HFpEF कि पता चलता है के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णित अलिंद remodeling22। प्रक्रिया अत्यधिक फैटी ऊतक शल्य तैयारी कर सकते हैं के रूप में व…
The authors have nothing to disclose.
इस अनुसंधान DZHK (हृदय अनुसंधान के लिए जर्मन केंद्र, D.B.), EKFS (और Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.), और BMBF (जर्मन शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से BIH-Charité नैदानिक वैज्ञानिक कार्यक्रम के रूप में वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था Charité-Universitätsmedizin बर्लिन और बर्लिन स्वास्थ्य संस्थान (F.H.) द्वारा ।
ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
Styrofoam surface | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
Tubing | |||
LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |