Isolamento dos Cardiomyocytes Atrial de um modelo do rato de metabólicas relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada
Summary
Aqui, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial de um modelo do rato de metabólica relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada. Uma regulação manual da pressão intraluminal de cavidades cardíacas é implementada para render funcionalmente intactos miócitos apropriados para estudos de acoplamento excitação-contração.
Abstract
Neste artigo, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial (ACMs) a partir de um modelo do rato da síndrome metabólica (MetS)-relacionadas com a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF). A prevalência de HFpEF relacionados com MetS está aumentando, e atrial cardiomiopatias associadas a remodelação atrial e fibrilação atrial são clinicamente altamente relevantes como a remodelação atrial é um preditor independente de mortalidade. Estudos com cardiomyocytes isolado de célula única são frequentemente usados para confirmar e complementar os achados na vivo . Rarefication de vasos circulatórios e fibrose do tecido intersticial representam um fator potencialmente limitante para o isolamento de célula única bem-sucedida do ACMs de modelos animais da doença.
Abordámos esta questão empregando um dispositivo capaz de regular manualmente a pressão intraluminal de cavidades cardíacas durante o procedimento de isolamento, aumentando substancialmente o rendimento do ACMs morfologicamente e funcionalmente intactos. As células adquiridas podem ser usadas em uma variedade de experiências diferentes, tais como cultura de células e imagiologia funcional de cálcio (ou seja, acoplamento excitação-contração).
Nós fornecemos o pesquisador com um protocolo passo a passo, uma lista de soluções otimizadas, completa instruções para preparar o equipamento necessário e um abrangente Guia de solução de problemas. A implementação inicial do processo pode ser bastante difícil, uma adaptação bem sucedida permitirá ao leitor realizar os isolamentos de ACM do estado-da-arte em um modelo do rato de HFpEF relacionados com MetS para um amplo espectro de experiências.
Introduction
MetS descreve um conjunto de fatores de risco para doenças cardiovasculares e diabetes mellitus tipo 2 e inclui uma aumento da pressão arterial, dislipidemia (gerado triglicerídeos e abaixou o colesterol da lipoproteína de alta densidade), aumentou o jejum glicose e obesidade central1. A prevalência mundial de MetS é estimada em 25 – 30% e constantemente crescente2. HFpEF é uma síndrome clínica heterogênea, frequentemente associada com MetS. A remodelação cardíaca durante HFpEF e suas fases anteriores (ou seja, doença cardíaca hipertensiva) também é acompanhada por uma remodelação dos átrios3. Função contrátil reduzida e mudanças estruturais da aurícula esquerda têm sido associadas com aumento da mortalidade, fibrilação atrial e insuficiência cardíaca de início novo4. Remodelamento atrial é caracterizada por alterações em função de canais de íon, homeostase de Ca2 + , estrutura atrial, ativação de fibroblastos e tecido fibrose5. Deixou a remodelação atrial HFpEF MetS-relacionados e seu subjacente mecanismos patológicos são ainda mal compreendidos e exigem uma investigação mais aprofundada. Modelos animais provaram ser uma ferramenta valiosa e levar a muitos avanços no campo de cardiomiopatias atrial6,7,8,9.
Estudos com cardiomyocytes isolado de célula única são frequentemente usados para confirmar e complementar os achados na vivo . Um isolamento e cultura de pilha subsequente potencial, permitem a investigação de sinalização de vias, correntes de canal iônico e acoplamento excitação-contração. Em condições fisiológicas, cardiomyocytes não se proliferam. A fusão entre as sequências reguladoras transcriptional de um fator de natriuretic atrial e um vírus simian 40 grande T antígeno em ratos transgénicos levou à criação das ACMs imortalizados primeiros, denominado AT-110. O desenvolvimento de células de AT-1 deu origem a células HL-1, que só não podem ser passadas em série, mas também espontaneamente contraem11. Eles, no entanto, mostram diferenças estruturais e funcionais, em comparação com células recém isoladas, tais como uma ultraestrutura menos organizada, uma alta ocorrência de desenvolver miofibrilas11e um-o hyperpolarization interno atual12. O isolamento dos cardiomyocytes ventricular (VCM) em ratos e camundongos de uma variedade de modelos é bem estabelecida13,14,15,16,17,18 , 19. geralmente, o coração extirpado é montado um aparato de Langendorff e retrogradely pintado com uma Ca2 +-buffer livre que contém enzimas digestivas, tais como colagenases e proteases. Cálcio é reintroduzido em seguida de forma gradual às condições fisiológicas. No entanto, apesar de protocolos dedicados ao isolamento da ACMs estão disponíveis20,21, devido ao aumento de fibrose e diferenças de pressão-relacionados, sua utilidade em modelos de doenças com remodelação atrial é limitada.
Neste artigo, temos implementado um protocolo para a isolação de atrial cardiomyocytes de célula única de animais que apresentem atrial remodelação (i.e., em especial para o modelo do rato de ZFS1 para HFpEF MetS-relacionados)22. Protocolos de isolamento existentes foram otimizados e complementados por um dispositivo simples, feitos sob medido para controlar e modificar a pressão intraluminal das cavidades cardíacas, levando a rendimentos mais elevados dos cardiomyocytes morfologicamente e funcionalmente intactos. O protocolo seguinte fornece o pesquisador com um guia passo a passo, uma descrição detalhada do equipamento feito sob medido, uma lista de soluções, bem como um abrangente Guia de solução de problemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, primeiro descrevemos um protocolo para o isolamento de célula única ACMs de um modelo do rato de MetS-relacionados HFpEF que mostra marcada remodelação atrial22. O procedimento é excepcionalmente desafiador como tecido adiposo excessivo pode fazer a preparação cirúrgica, bem como a canulação da aorta, cada vez mais difícil. O guia de solução de problemas fornecidas na tabela 2 endereços os problemas mais comuns do processo de isolamento.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo DZHK (centro alemão de pesquisa Cardiovascular, D.B.), o EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.) e pelo BMBF (Ministério alemão de educação e pesquisa), bem como a BIH-Charité financiados pelo programa cientista clínico por Charité – Universitätsmedizin Berlim e Berlim Institute of Health (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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