Изоляция предсердий кардиомиоцитов из крыса модели метаболических связанных с синдром сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранившихся
Summary
Здесь мы описываем оптимизированный, основанные на Langendorff процедура для изоляции одноклеточных предсердий кардиомиоцитов из крыса модели метаболических связанных с синдром сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранились. Ручного регулирования давления внутрипросветная полостей сердца реализуется, чтобы принести функционально нетронутым миоцитах подходит для возбуждения сужение муфта исследований.
Abstract
В этой статье мы опишем оптимизированный, основанные на Langendorff процедура для изоляции одноклеточных предсердий кардиомиоцитов (мах) от мышиной модели метаболического синдрома (Мец)-связанных с сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранились (HFpEF). Распространенность связанных с Мец HFpEF растет, и предсердий кардиомиопатии, связанные с предсердной ремоделирования и фибрилляция предсердий клинически весьма актуальны, поскольку предсердная ремоделирования является независимым предиктором смертности. Исследования с изолированных cardiomyocytes одноклеточных часто используются для подтверждения и дополнения выводов в естественных условиях . Rarefication кровообращения судна и фиброз интерстициальной ткани создают потенциально ограничивающим фактором для успешного одноклеточных изоляции Мах от животных моделей этого заболевания.
Мы затрагивали этот вопрос, используя устройство, способное вручную регулирования давления внутрипросветная полостей сердца во время процедуры изоляции, существенно увеличивая урожайности морфологически и функционально нетронутым мах. Полученные клетки может использоваться в различных различных экспериментов, например культуры клеток и функциональной кальция томографии (то есть, возбуждения сужение муфта).
Мы предоставляем исследователь с шаг за шагом протокола, список оптимизированных решений, тщательного инструкции подготовить необходимое оборудование и всеобъемлющее руководство по устранению неполадок. Хотя первоначальное осуществление процедуры может быть довольно сложно, успешная адаптация позволит читателю для выполнения изоляции ACM-искусство в мышиной модели связанных с Мец HFpEF для широкого спектра экспериментов.
Introduction
Мец описывает кластер факторов риска для сердечно-сосудистые заболевания и сахарный диабет 2 типа и включает повышение артериального давления, дислипидемия (подняли уровень триглицеридов и снижение холестерина липопротеидов высокой плотности), увеличилось поста глюкоза, а Центральное ожирение1. Во всем мире распространенность Мец оценивается в 25 – 30% и постоянно растущей2. HFpEF представляет собой разнородные клинический синдром, часто ассоциируется с Мец. Сопровождается также Ремоделирование предсердия3сердца ремоделирования ее предыдущих этапах (то есть, гипертоническая болезнь) и HFpEF. Снижение сократительной функции и структурные изменения левого предсердия были связаны с повышенной смертности, фибрилляция предсердий и новым началом сердечной недостаточности4. Предсердий ремоделирования характеризуется изменениями в ионных каналов, Ca2 + гомеостаза, предсердная структуры, активации фибропластов и фиброз тканей5. Оставил предсердий Ремоделирование в связанных с Мец HFpEF и лежащие в его основе патологические механизмы все еще плохо поняты и требуют дальнейшего углубленного расследования. Животные модели оказались ценным инструментом и привести к многие достижения в области предсердий кардиомиопатии6,,78,9.
Исследования с изолированных cardiomyocytes одноклеточных часто используются для подтверждения и дополнения выводов в естественных условиях . Изоляции и потенциальных последующих клетки культуры, позволяют для расследования случаев сигнальные пути, ионного канала токов и возбуждения сужение муфта. В физиологических условиях не размножаются кардиомиоцитов. Слияние между транскрипционный анализ нормативных последовательности atrial natriuretic фактор и Обезьяний вирус 40 больших T антигена в трансгенных мышей привело к созданию первого увековечен мах, названный AT-110. Дальнейшее развитие АТ-1 клеток породило клеток HL-1, которые не только быть пассированной серийно, но также контракта спонтанно11. Они однако, показать структурные и функциональные различия по сравнению с свежевыделенных клеток, таких как менее организованных Ультраструктура, высокая вхождения развивающихся миофибрилл11и активирован гиперполяризации внутрь текущего12. Изоляция кардиомиоцитов желудочков (VCM) у крыс и мышей от различных моделей является хорошо установленным13,14,,1516,17,18 , 19. как правило, крепится к Langendorff аппарат и retrogradely увлажненную с Ca2 +подакцизным сердце-Бесплатная буфер, содержащий пищеварительные ферменты, такие как коллагеназы и протеаз. Кальция затем восстановлена на основе поэтапного в физиологических условиях. Однако даже несмотря на то, что протоколы, посвященный изоляции платежных терминалов, имеющиеся в20,21, благодаря увеличению фиброз и различия, связанные с давлением, их полезность в моделях заболеваний с предсердной ремоделирования является ограниченным.
В этой статье мы реализовали протокол для изоляции предсердий кардиомиоцитов одноклеточных животных, которые показывают предсердий ремоделирования (т.е., в частности для ZFS1 крысы модель для связанных с Мец HFpEF)22. Существующие протоколы изоляции были оптимизированы и дополнены простой, заказной устройства для контроля и изменение давления внутрипросветная полостей сердца, приводит к повышению урожайности морфологически и функционально нетронутым кардиомиоцитов. Следующий протокол обеспечивает исследователь с пошаговое руководство, подробное описание оборудования по индивидуальному заказу, список решений, а также всеобъемлющее руководство по устранению неполадок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы впервые описал протокол для изоляции одноклеточных Мах от мышиной модели связанных с Мец HFpEF, показывающий отмечен предсердий ремоделирования22. Процедура является уникально сложной, как излишней жировой ткани может сделать хирургической подготовки, а также кате?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано DZHK (Немецкий центр исследования сердечно-сосудистой системы, д.б.), EKFS (остальное-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.) и BMBF (Немецкий Министерство образования и научных исследований), а также финансируемые программы клинических ученый Биг-Шарите по Charité – этот Берлин и Берлин институт здравоохранения (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochimie. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
