Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón
Summary
El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.
Abstract
Neurodegeneración de espinales motoneuronas (MNs) está implicada en un amplio espectro de los trastornos neurológicos como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, atrofia muscular, que son asociados con atrofia muscular. Cultivos primarios de MNs espinales se han utilizado extensamente para demostrar la implicación de genes específicos en este tipo de enfermedades y caracterizar las consecuencias celulares de sus mutaciones. Esta cultura de modelos un MN primaria protocolo deriva de la obra seminal de Henderson y colegas hace más de veinte años. En primer lugar, detalle un método de disección de los cuernos anteriores de la médula espinal de un embrión de ratón y aislar el MNs de los vecinos las células utilizando un gradiente de densidad. A continuación, presentamos una nueva forma de transferencia eficiente MNs con plásmidos de expresión utilizando magnetofection. Finalmente, ilustramos cómo solucionar y immunostain primaria que mns mediante mutaciones de neurofilamentos que causan la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo muestra un enfoque cualitativo a la expresión de proteínas de interés y estudiar su participación en MN el crecimiento, mantenimiento y supervivencia.
Introduction
Enfermedades neuromusculares abarcan una gran variedad de patologías clínicamente y genéticamente distintos que se caracterizan por la alteración del músculo o del sistema nervioso. Debido a los avances en tecnologías de secuenciación, se han identificado cientos de genes responsables de estas enfermedades raras durante la última década (lista disponible en el centro de enfermedad Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variedad de mutaciones identificadas indica que diferentes mutaciones en un solo gen pueden producir diferentes fenotipos y enfermedades1,2,3 y que las mutaciones en distintos genes pueden producir fenotipos similares 4 , 5. en este contexto, hay esfuerzos para el desarrollo de modelos celulares que pueden convertirse en poderosas herramientas para el análisis de las consecuencias de la mutación y mecanismos patológicos.
MNs espinales tienen grandes somas en los cuernos ventrales de la médula espinal, axones largos forma a las fibras de músculo esqueléticas y permitir movimientos voluntarios a través de la liberación de acetilcolina en uniones neuromusculares. Desde MNs están afectados por enfermedades neuromusculares como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT), y la atrofia muscular espinal, Dr. Henderson y colegas desarrollaron el primer protocolo6 que permitió para el cultivo de in vitro espinales MNs y el descubrimiento de neurotrophic del factor GDNF7 (factor neurotrófico derivado de células gliales). Ajustes técnicos desde entonces han permitido la purificación más precisa de MNs espinales y sus subtipos utilizando FACS8y enriquecimiento por gradiente de densidad sigue siendo potente y ampliamente utilizado en laboratorios trabajando con MNs espinales primarias 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, también es posible obtener un mayor grado de purificación de MN a través de immunopanning tomando ventaja del marcador superficial p75(NTR)15,16,17.
La médula espinal contiene diferentes subtipos de MNs cervicales, torácicas y lumbares, así como columnas motor medianas y lateral que difieren según su ubicación en el cuerno anterior en un eje dorsoventral y entre los blancos inervan8, 18. las culturas MN primaria pueden recuperar todos estos subtipos de MN en proporciones fisiológicas. La principal limitación de esta técnica es el bajo número de MNs obtenidos al final del procedimiento. de hecho, puede esperarse obtener alrededor de 105 MNs de seis embriones, que es conveniente para microscopía pero limitante para experimentos de bioquímica. Para llevar a cabo experimentos con subtipos más estandarizados y MNs abundante (> 106 células), embrionario MNs derivados de la célula de vástago deben ser considerados18.
Transfección de transgenes salvaje-tipo/mutante o precipitación genes endógenos en MNs primarias es una herramienta rápida y útil para descifrar las vías fisiopatológicas, especialmente cuando no están disponibles modelos de ratón. Magnetofection es una técnica de transferencia primaria las neuronas, similares a lipofection sin la neurotoxicidad relacionada. Además, transfección puede realizarse en neuronas maduras, después de varios días en vitro, a diferencia de técnicas de electroporación9. Sin embargo, una desventaja de esta técnica es que los granos unen los ácidos nucleicos en la cultura, causando ruido en el etiquetado de DAPI. Infección viral es probablemente la técnica más eficaz para transfectar MNs; sin embargo, magnetofection no requiere de ciertos procedimientos de seguridad necesarios para la producción viral y la infección celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uno de los puntos críticos de este protocolo es que se disecan los embriones de ratón en una ventana de tiempo preciso durante el desarrollo (E12.5) para optimizar la cantidad de MNs obtenida al final. Además, para un rendimiento óptimo, la disección debe realizarse por la mañana o temprano por la tarde. Antes de E12.5 (por ejemplo, en E11.5), la disección es difícil, especialmente con respecto a la eliminación de las meninges. Después de E12.5, el número de MNs obtenidas cae significativamente. Para …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la “Association pour le développement de la neurogénétique” para la beca Dr. Jacquier y AFM Telethon por su apoyo a través del plan estratégico MyoNeurAlp. También nos gustaría agradecer al Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul y Dr. Georg Haase, que participaron en el desarrollo y mejora de la técnica y difundir sus conocimientos.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
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