النمذجة شاركو-ماري الأسنان المرض في المختبر من قبل ترانسفيكتينج موتونيورونس الابتدائي الماوس
Summary
والهدف من هذا الأسلوب إعداد ثقافة موتونيورونس الأولية (MNs) من الحبل الشوكي مورين التخصيب. لتقييم آثار الطفرات التي تسبب الأمراض مينيسوتا، يصف لنا هنا معزولة عزل هذه MNs وما تعداء من ماجنيتوفيكشن.
Abstract
نيوروديجينيريشن موتونيورونس العمود الفقري (MNs) المتورطة في طائفة واسعة من اضطرابات عصبية، بما في ذلك التصلب العضلي الجانبي ومرض شاركو-ماري الأسنان وضمور العضلات الشوكي، التي ترتبط كلها بضمور العضلات. الثقافات الأولية للعمود الفقري MNs استخدمت على نطاق واسع لإثبات تورط جينات محددة في مثل هذه الأمراض، وتميز بالآثار المترتبة على الطفرات الخلوية. هذا البروتوكول نماذج مينيسوتا أساسي الثقافة المستمدة من العمل المنوي هندرسون والزملاء منذ أكثر من عشرين عاماً. أولاً، أننا بالتفصيل طريقة تشريح قرون الأمامي من الحبل الشوكي من جنينا ماوس وعزل MNs من الخلايا باستخدام تدرج كثافة المجاورة. ثم، فإننا نقدم طريقة جديدة لكفاءة ترانسفيكتينج MNs مع البلازميدات التعبير باستخدام ماجنيتوفيكشن. أخيرا، نحن لتوضيح كيفية إصلاح وإيمونوستين الابتدائي MNs. استخدام الطفرات نيوروفيلامينت التي تسبب-شاركو ماري الأسنان المرض نوع 2، هذا البروتوكول يوضح نهجاً نوعيا للتعبير عن البروتينات للفائدة وتدرس مشاركتها في النمو MN، والصيانة، والبقاء على قيد الحياة.
Introduction
الأمراض العصبية العضلية تشمل مجموعة متنوعة من الأمراض سريرياً ووراثيا المتميزة التي تتميز بها تحوير العضلات و/أو الجهاز العصبي. وقد حددت مئات جينات المسؤولة عن هذه الاضطرابات النادرة بسبب التقدم في تكنولوجيا التسلسل، خلال العقد الماضي (قائمة متوفرة في مركز الأمراض نيوروموسكولار، http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). مجموعة متنوعة الطفرات التي تم تحديدها ويشير إلى أن الطفرات المختلفة في جين واحد يمكن أن يسبب تعمل المختلفة والأمراض1،،من23 والتي يمكن أن تنتج الطفرات في جينات مختلفة تعمل مماثلة 4 , 5-وفي هذا السياق، هناك جهود تبذل لتطوير نماذج الخلوية التي يمكن أن تصبح أدوات قوية لتحليل آثار الطفرة والآليات المرضية.
MNs العمود الفقري لديها اتفاقات كبيرة تقع في قرون البطني الحبل الشوكي، شكل محاور عصبية طويلة لاستهداف ألياف العضلات الهيكلية، وتسمح بالانتقال الطوعي من خلال إطلاق سراح أستيل في الوصلات العصبية العضلية. ولما MNs تتأثر بأمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي، شاركو-ماري الأسنان المرض (CMT)، وضمور العضلات الشوكي، والدكتور هندرسون والزملاء وضع البروتوكول الأول6 يسمح بزراعة في المختبر MNs العمود الفقري واكتشاف نيوروتروفيك عامل جدنف7 (الخلية الدبقية مشتقة من نيوروتروفيك عامل). مكنت التحسينات التقنية منذ ذلك الحين لتنقية أكثر دقة MNs العمود الفقري والأنواع الفرعية الخاصة بها باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية8، ولكن يظل الإثراء بالتدرج كثافة قوية والمستخدمة على نطاق واسع في المختبرات التي تعمل حاليا مع MNs العمود الفقري الأولية 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14-وفي وقت لاحق، من الممكن أيضا الحصول على أعلى درجة تنقية مينيسوتا عن طريق إيمونوبانينج بالاستفادة من السطح علامة p75(NTR)15،،من1617.
الحبل الشوكي يحتوي على أنواع فرعية مختلفة من MNs عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر، فضلا عن الأعمدة موتور الوسطية والجانبية التي تختلف باختلاف مواقعها في القرن الأمامي على محور دورسو البطني ومن بين الأهداف التي يعصب8، 18-“مينيسوتا الأساسي” الثقافات يمكن استرداد كافة هذه الأنواع الفرعية مينيسوتا في نسب الفسيولوجية. القيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو انخفاض عدد MNs تم الحصول عليها في نهاية الإجراء؛ في الواقع، فإنه يمكن توقع الحصول على حوالي 105 MNs من الأجنة الستة، ومناسبة للفحص المجهري ولكن الحد لتجارب الكيمياء الحيوية. للقيام بتجارب مع أكثر فرعية موحدة ووفرة MNs (> 106 خلايا)، الجنينية المستمدة من الخلايا الجذعية MNs ينبغي النظر في18.
تعداء المتسلسلات البرية-نوع/المسخ أو الجينات الذاتية ضربة قاضية إلى MNs الرئيسي أداة سريعة ومفيدة لفك رموز مسارات فيسيوباثولوجيكال، لا سيما عندما لا تتوفر نماذج الماوس. ماجنيتوفيكشن أسلوب واحد للعصبية الأولية ترانسفيكتينج، شبيه ليبوفيكشن دون السمية العصبية ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تعداء على الخلايا العصبية الناضجة بعد عدة أيام في المختبر، خلافا لتقنيات استناداً إلى انهانسر9. ومع ذلك، عيب واحد من هذه التقنية أن الخرز ربط الأحماض النووية في الثقافة، تسبب الضوضاء في وسم DAPI. العدوى الفيروسية المرجح هو الأسلوب الأكثر كفاءة ل MNs ترانسفيكتينج؛ ومع ذلك، لا يتطلب ماجنيتوفيكتيون بعض إجراءات السلامة اللازمة لإنتاج الفيروسية والعدوى الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحدة من النقاط الحرجة في هذا البروتوكول أن يتم تشريح الأجنة الماوس في إطار زمني دقيق خلال التنمية (E12.5) لتحسين مقدار MNs تم الحصول عليها في النهاية. وبالإضافة إلى ذلك، للعائد الأمثل، ينبغي إجراء التشريح في الصباح أو بعد الظهر. قبل E12.5 (مثلاً، في E11.5)، تشريح الصعبة، لا سيما فيما يتعلق بالق…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر “الرابطة من أجل le neurogénétique de la التنمية” للدكتور جاككوير للزمالات وفؤاد-الحفل الخيري لدعمها من خلال الخطة الاستراتيجية ميونيورالب. كما نود أن نشكر الدكتور كريس هندرسون، الدكتور وليام Camu والدكتور بريجيت بيتمان، الدكتور سيدريك راؤول والدكتور جورج هاس، الذين شاركوا في تطوير وتحسين هذه التقنية ونشر هذه المعرفة.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
