마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링
Summary
이 기법의 목표는 murine 척수에서 기본 motoneurons (MNs)의 매우 풍부한 문화를 준비. 설명만 질병을 일으키는 돌연변이의 결과 평가 하려면 여기 이러한 격리 절연 MNs 및 그들의 transfection magnetofection에 의해.
Abstract
척추 motoneurons (MNs)의 Neurodegeneration 등 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, 척추 근육 위축, 근육 위축과 모두 관련 된 신경 성 질환의 큰 스펙트럼에 연루 이다. 척추 MNs의 기본 문화 같은 질병에 특정 한 유전자의 관련을 설명 하 고 그들의 변이의 세포 결과 특성화에 널리 사용 되어 왔습니다. 이 프로토콜 모델 기본 미네소타 문화 파생 헨 더 슨과 동료의 정액 일에서 20 년 이상 전에. 첫째, 우리는 마우스 배아에서 척수의 앞쪽 뿔을 해 부하 고 밀도 그라디언트를 사용 하 여 셀을 이웃에서 MNs를 분리 하는 방법 선발. 다음, 우리는 효율적으로 magnetofection를 사용 하 여 식 플라스 미드와 MNs를 transfecting의 새로운 방법을 제시. 마지막으로, 우리는 수정 하는 방법과 immunostain MNs. Charcot Marie이 질병 유형 2 원인 neurofilament 변이 사용 하 여,이 프로토콜 하 관심사의 단백질을 표현 하 고 있는 그들의 관련을 공부 질적 방법을 보여 주 설명 미네소타, 유지 보수, 성장과 생존입니다.
Introduction
신경 근육 학 질병 근육 및 신경 시스템의 변경에 의해 특징은 임상 및 유전으로 명료한 pathologies의 다양 한을 포함 됩니다. 시퀀싱 기술 발전, 때문에 유전자가 희귀 질환에 대 한 책임의 수백 지난 10 년 동안 확인 되었습니다 (Neuromuscular 질병 센터에서 사용할 수 있는 목록 http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). 확인 된 돌연변이의 다양 한 다른 고기 및 질병1,,23 다른 돌연변이 단일 유전자에서 발생할 수 있습니다 나타내고 다른 유전자에 돌연변이 비슷한 고기를 생산할 수 있는 4 , 5. 이러한 맥락에서 돌연변이 결과 및 병 적인 메커니즘을 분석 하기 위한 강력한 도구가 될 수 있는 휴대 전화 모델을 개발 하는 노력 있다.
척추 MNs는 척수의 복 부 뿔 형태 긴 축 삭 골격 근육 섬유를 타겟으로하 고 신경 근육 접합부에서 아 세 틸 콜린의 출시를 통해 자발적인 움직임에 대 한 허용에 있는 큰 somas는. MNs는 루 경화 증, Charcot Marie이 질병 (CMT), 신경 근육 학 질병에 의해 영향을 때문에 척추 근육 위축, 닥터 헨 더 슨과 동료 의 재배에 대 한 허용 된 첫 번째 프로토콜6 개발 생체 외에서 척추 MNs 및 科의 발견 요소 GDNF7 (glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인). 그 이후 기술 상세 척추 MNs 및 FACS8를 사용 하 여 그들의 하위의 더 정확한 정화에 대 한 허용 하지만 밀도 그라데이션에 의해 농축 남아 기본 척추 MNs 작업은 현재 실험실에서 강력 하 고 널리 사용 되 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 그 후, 그것은 또한 표면 마커 p75(NTR)15,,1617의 활용 하 여 immunopanning 통해 높은 미네소타 정화 등급을 얻을 수.
척수 포함 dorso 복 부 축에 전방 경적에서 그들의 위치 사이에서 다른 중간과 측면 모터 열으로 자 궁 경부, 흉부, 요 추 MNs의 다른 하위 및 표적 중 그들은 자극8, 18. 주 미네소타 문화 생리 적인 비율에 이러한 미네소타의 모든를 복구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 한계는 프로시저;의 끝에 얻은 MNs의 낮은 수 사실, 그것은 현미경 검사 법 그러나 생화학 실험에 대 한 제한에 대 한 적당 한 6 개의 배아에서 약 105 MNs를 얻을 것으로 예상 수 있습니다. 더 표준화 된 하위와 풍부한 MNs 실험을 수행 하기 위해 (> 106 셀), 배아 줄기 세포 유래 MNs18고려 되어야 한다.
기본 MNs로 야생-타입/돌연변이 transgenes 또는 최저의 내 생 유전자의 transfection는 특히 마우스 모델 사용할 수 없을 때 physiopathological 경로 해독에 대 한 신속 하 고 유용한 도구입니다. Magnetofection은 transfecting 기본 신경, 관련된 neurotoxicity 없이 lipofection와 비슷한 하나의 기술입니다. 또한, 몇 일 후 체 외에서electroporation9에 따라 기술 달리 성숙한 뉴런에 transfection은 수행할 수 있습니다. 그러나, 한이 기술의 단점은 구슬 DAPI 라벨에 잡음을 일으키는 문화에서 핵 산 바인딩입니다. 바이러스 감염 가능성이 transfecting MNs;에 대 한 가장 효율적인 기술 이다 그러나, magnetofection는 바이러스 생산 및 세포 감염에 필요한 특정 안전 절차를 필요 하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 중요 한 포인트 중 하나는 마우스 배아는 개발 (E12.5) 끝에 얻은 MNs의 양을 최적화 하는 동안 정확한 시간대에 해 부입니다. 또한, 최적의 생산량에 대 한 해 부 수행 되어야 한다 아침 이나 이른 오후에. E12.5 (예를 들어, E11.5에서), 전에 해 부가 어렵습니다, 특히 meninges의 제거에 관한. E12.5, 후 얻은 MNs의 수는 크게 떨어진다. 개발의 배아 단계 제어, 성인 여성 및 남성 처음 배…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 “협회 부 르 지속 가능성 드 라 neurogénétique” 박사 Jacquier의 친목 및 AFM-텔 레 톤 MyoNeurAlp 전략적 계획을 통해 그것의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 박사 크리스 헨 더 슨, 박사 윌리엄 Camu, 박사 Brigitte Pettmann, 박사 세 드 릭 라울, 누가 개발 하 고 기술 향상에 참가 하 고 그들의 지식을 전파 하는 박사 게오르그 세 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
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