Hier presenteren we een protocol om te injecteren van autologe spier-afgeleide cellen van de stam in de nabijheid van de terugkerende laryngeal zenuw met behulp van een elektrische zenuw stimulator. Deze nieuwe techniek wellicht nuttig is voor de behandeling van paardachtigen terugkerende laryngeal neuropathie.
Terugkerende laryngeal neuropathie (RLN) vaak invloed op paarden en wordt gekenmerkt door abnormale respiratoire geluiden en oefening intolerantie. De terugkerende laryngeal zenuw toont laesies van demyelinisatie. Het voordeel van het toepassen van stamcellen op demyelinated zenuwen is aangetoond in verschillende diermodellen. Het doel van de studie was om te testen de haalbaarheid en de veiligheid van een peri-neuronale injectie van autologe spier afkomstige mesenchymale stamcellen aan de linker terugkerende laryngeal zenuw in gezonde paarden met behulp van een elektrische zenuw stimulator.
Spier-afgeleide stengels cel worden vijf gezonde Standardbred paarden verkregen door bemonstering van 20 mg spierweefsel met een semi-automatische 14 G biopsie naald uit de Musculus triceps. Bewegingen van het strottenhoofd zijn gecontroleerde via Opper-airway video endoscopie. De linker terugkerende laryngeal zenuw wordt benaderd met een geïsoleerde zenuw blok naald. Zenuwstimulatie is toegepast, basisgewicht van 2 mA, en de succesvolle ontvoering van de linker arytenoid wordt gecontroleerd. De intensiteit van de stimulatie is geleidelijk verminderd. Wanneer een verlies van de motorische reactie is waargenomen bij 0,5 mA, 107 autologe spier afkomstige stam cellen worden geïnjecteerd. Twee onderzoekers, die op het punt van de tijd zijn verblind, scoren de laryngeal functie van de paarden voorafgaand aan de behandeling en op dag 1, dag 7 en dag 28 na de injectie van de cellen. In een zesde paard, wordt 1 mL 2% lidocaïne geïnjecteerd om verder te bevestigen de juiste positionering van de naald. Dit leidt tot een tijdelijke verlamming van de linker arytenoid kraakbeen.
Deze studie bewijst dat de terugkerende laryngeal zenuw kan worden benaderd met behulp van een elektrische zenuw stimulator en dat de elektrische stimulatie van de zenuw goed wordt verdragen door de paarden. Geen wijziging van de laryngeal functie werd waargenomen in een van de paarden na de injectie van de cellen van de stam. Verdere studies moeten worden uitgevoerd om te beschrijven de effecten van een peri-neuronale injectie van autologe spier afkomstige mesenchymale stamcellen voor paarden lijden aan RLN.
RLN is een gemeenschappelijk pathologie van de bovenste luchtwegen bij paarden gekenmerkt door wisselend arytenoid verlamming. De linkerkant van het strottenhoofd wordt meestal beïnvloed. De prevalentie van de ziekte kan bereiken tot 35% in bepaalde bevolkingsgroepen paard. Hoewel verschillende hypothesen probeerde uit te leggen van de etiologie en pathogenese van de ziekte, blijft de precieze oorzaak van RLN onzeker. De pathologie wordt beschreven als een distale axonopathy van de terugkerende laryngeal zenuw met laesies van demyelinisatie maar ook een zekere mate van remyelination. Deze axonopathy leidt tot de denervation van de intrinsieke laryngeal spieren en atrofie van de daarmee gepaard gaande1,2. Deze pathologie is vaak langzaam progressief en kan leiden tot een totaal verlies van de arytenoid ontvoering van de aangedane zijde3.
Getroffen paarden abnormale respiratoire geluiden uitstoten tijdens de training en oefening intolerantie soms vertonen in meer ernstige gevallen. De definitieve diagnose wordt gesteld door de endoscopische behandeling op een niet-verdoofd staande paard waar een gedeeltelijke of totale verlies van laryngeal ontvoering1,2,4wordt waargenomen. Momenteel is de meest voorkomende behandeling laryngoplasty (ook bekend als “tie-back”), die wordt soms geassocieerd met een ventriculo-cordectomy. Hoewel het algehele slagingspercentage van deze operaties is beschouwd als goed tot uitstekend5, komen postoperatieve complicaties zeer vaak. De meest voorkomende complicatie is een geleidelijk verlies van ontvoering. Barnett et al. 6 rapporteerde een verlies van ten minste één graad van ontvoering binnen de eerste zes weken na de operatie in ten minste 76% van de paarden. Andere complicaties, zoals het falen van de prothese, hoesten en airway besmetting, zijn ook gemeld5.
Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn een deel van de paarden geneeskunde in onderzoek en praktijk geweest voor meer dan een decennium, hoewel bewezen studies over hun efficiëntie nog schaars zijn. De twee meest uitgebuite bronnen van volwassen mesenchymale stamcellen in paarden zijn beenmerg en vetweefsel7. Beide bemonsteringstechnieken zijn relatief invasief en niet altijd leiden tot een voldoende aantal cellen. Onlangs, Ceusters et al. 7 beschreven de cultuur van de stamcellen afgeleid van dwarsgestreept spierweefsel, die wordt verkregen door een minder invasieve techniek van de microbiopsy.
MSCs zijn geschikt voor zelf-vernieuwing, zelf-generatie multipotent en differentiatie7,8. Hun vermogen om te onderscheiden in alle mesoderm lineages van vet-, bot-, spier- en kraakbeen wordt nu gevestigde9. Echter in bepaalde milieuomstandigheden, kunnen ze onderscheiden in niet-mesenchymale lineages zoals neuronen, astrocyten en myelinating cellen van het perifere zenuwstelsel en het ruggenmerg9,10. MSCs zijn al gebruikt in verschillende neuropathie modellen-10,11. Hun vermogen om te migreren naar gebieden van ontaarde zenuwweefsel en te regenereren neurale cellen is gebleken na een systemische en lokale administratie11. Bovendien kunnen cellen van Schwann-achtige afgeleid van MSCs macrofagen afscheiden neurotrophic factoren bevorderen van axonale groei en remyelination9te verwijderen van cellulaire puin rekruteren.
Het doel van deze studie is om te beschrijven van de techniek van een zenuw stimulator geleide injectie van autologe stamcellen in de buurt van de linker terugkerende laryngeal zenuw in gezonde paarden spier-afgeleide. Typisch, een stimulator van de zenuw verbonden met een injectie naald wordt gebruikt om de electro-lokalisatie van perifere zenuwen toepassing van lokale verdoving op dat gebied12. Een zwakke gelijkstroom impuls wordt geleverd in de nabijheid van de zenuw voor het opwekken van een motorische reactie. Het vermogen te produceren deze motor reactie is afhankelijk van diverse parameters, zoals de geleidende gebied van de naald, een impedantie van het weefsel, de huidige toegepast, de impulstijd en de afstand van de naald tot de zenuw. Zenuw stimulator naalden zijn ontworpen om een zeer restrictieve geleidende gebied op het puntje van de naald, terwijl de rest van de naald is geïsoleerd. Dit ontwerp helpt om de zenuw nauwkeurig te lokaliseren. Moderne zenuw stimulatoren aan te passen aan wisselende weefsel impedances en leveren de constante stroomsterkte ingesteld op de machine. Bovendien, de meeste machines gebruik maken van een impulstijd van 0,1 s, zodat de bepalende parameters zijn de huidige toegepast en de afstand tot de naald. De relatie tussen de naald-naar-zenuw afstand en de huidige noodzakelijk zijn voor het produceren van een motorische reactie wordt beschreven door de wet van Coulomb: E = kQ/r; waar E is de lading van de vereiste stimulatie, k is de constante van Coulomb, Q is de lading van de minimaal vereiste stimulatie en r is de afstand tussen de twee elektroden. In de elektro-lokalisatie van zenuwen, de afstand tussen de twee elektroden wordt beschouwd als de naald-naar-zenuw afstand12. Elektrische lading verdwijnt na de regel van het omgekeerde kwadraat van de afstand van de naald-naar-zenuw13. Klinische praktijk heeft aangetoond dat de motor zenuwen stimulatie op 0,5 mA is sterk gecorreleerd aan het succesvolle zenuw blok en dat een verlies van signaal van de motor op lagere stromingen belet de gebruiker beheer van accidentele intraneuronal injecties. Het doel van deze studie is om te testen de haalbaarheid en de veiligheid van deze techniek in een beperkt aantal paarden. Als de haalbaarheid en de veiligheid van deze techniek worden bevestigd, kan het gemakkelijk worden overgedragen aan getroffen paarden. Verdere, paarden RLN kan dienen als een model voor perifere degeneratieve neuropathie.
Dit protocol beschrijft de succesvolle toepassing van autologe stamcellen spier-afgeleid naar de terugkerende laryngeal zenuwen bij paarden met behulp van een zenuw stimulator geleide aanpak. De oogst van de spier microbiopsy specimen, alsmede de isolatie, cultuur en karakterisering van de stamcellen, zijn beschreven in detail voor, terwijl de injectie van deze cellen in de nabijheid een perifere zenuw is origineel. De electro-lokalisatie van de zenuw met een elektrische zenuw stimulator heeft gediend voor de huidige studie en werd gebruikt om te injecteren mesenchymale stamcellen in de onmiddellijke nabijheid van de terugkerende laryngeal zenuw. De motorische reactie werd gecontroleerd door video endoscopie via de Nasofarynx. Indien tijdens de positionering van de naald andere zenuwen werden gestimuleerd, was de bijbehorende beweging zichtbaar op het scherm van de endoscopie. Een succesvolle stimulatie van de terugkerende laryngeal zenuw werd gekenmerkt door de typische ontvoering van de arytenoid kraakbeen. In één paard, werd lokale verdoving geïnjecteerd om een tijdelijke verlamming van de arytenoid spier. Alhoewel de succesvolle inplanting van de cellen in de nabijheid van de zenuw niet specifiek in de huidige studie is getest, bleek de electro-lokalisatie van de zenuw en de injectie bij een lage stroom dat de stamcellen werden toegepast in de buurt van de zenuw. De nabijheid van de injectate naar de zenuw werd verder aangetoond door een succesvolle motor blok geïnduceerd door een injectie van een plaatselijke verdoving.
In de resterende vijf paarden, de tijd van de eerste stimulatie totdat de injectie van de cel van de stam van de succesvolle van 3 tot 12 min. varieerde paarden waren enigszins gedrogeerd tijdens de procedure, die hun naleving van de elektrische stimulatie verhoogd. Geen van de paarden toonden bijwerkingen op elk gewenst moment, waaruit blijkt dat de duur van de stimulatie kan worden verlengd indien nodig om de goede naald positionering. Een steile het leren kromme wordt verwacht te worden nageleefd als de exploitant is met behulp van deze techniek regelmatig en in een groter aantal paarden met verschillende anatomie.
Paarden vaak lijden aan RLN, dat wordt gekenmerkt door verschillende graden van verlamming van de linker arytenoid kraakbeen leiden tot abnormale respiratoire geluiden en de uitoefening van de intolerantie. Een histologie van de getroffen zenuwen onthult typische laesies van perifere neuropathie16. Perifere neuropathie is een term gebruikt om verschillende soorten letsels van de perifere zenuwen wat leidt tot verminderde sensaties, bewegingen of orgaanfuncties. De oorzaken zijn zeer variabel en eventueel diabetes, tekorten, een behandeling met specifieke geneesmiddelen, een traumatisch letsel, ischemie of een infectie, of ze kunnen idiopathische. Onafhankelijk van de oorzaak, perifere neuropathieën delen voorkomende histopathologisch symptomen, zoals Wallerian degeneratie, distale axonopathy of segmentale demyelinisatie. Het is aangetoond dat de administratie van mesenchymale stamcellen om beschadigde perifere zenuwen mogelijk gunstig voor hun rehabilitatie; de onderliggende mechanismen worden echter niet goed begrepen. Traditioneel, wij zijn van mening dat mesenchymale stamcellen zal alleen onderscheid in progenitorcellen van adipeus, spieren, kraakbeen en botweefsel, maar onder bepaalde voorwaarden, ze is gebleken om te differentiëren in myocytes17, astrocyten18 , en myelinating cellen van de perifere19 en centrale zenuwstelsel19. Tijdens een in vitro cultuur, een blootstelling aan neuropeptides zal het voordeel van de differentiatie van mesenchymale stamcellen in cellen uiten van neuronale markeringen21,22. Verschillende in vivo studies hebben aangetoond dat de gunstige invloed van mesenchymale stamcellen op zenuw regeneratie en een functionele herstel in rat modellen van10,23van de schade van de nervus ischiadicus. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door gunstige omgevingsfactoren die aan de differentiatie van stamcellen in weefsel-specifieke cellen24 bijdragen. Toekomstige studies moeten ook onderzoeken deze techniek voor het beheer van pre gedifferentieerde cellen in RLN getroffen paarden.
Voor het beste van onze kennis is dit het eerste verslag dat het gebruik van een stimulator van de zenuw beschrijft te lokaliseren een perifere zenuw te injecteren een specifieke behandeling erin. Andere pathologieën van de perifere zenuwen in verschillende soorten, zoals neuropatische pijn, kunnen worden behandeld door de administratie van stamcellen in de nabijheid van de zenuw25,26. Toekomstige studies moeten testen van het effect van deze techniek in klinische patiënten en onderzoeken van het risico van migratie en de mogelijkheden van differentiatie van de geïnjecteerde cellen.
The authors have nothing to disclose.
De studie is gefinancierd door het Equine onderzoekscentrum van Mont-le-Soie.
Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG – 14090C | |
Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
DMEM – F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
Trypsin | Life technologies | 12604 | |
HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
NaCl | Sigma | S8776 | |
T-25cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |