Här presenterar vi ett protokoll för att injicera autologt muskel-derived stamceller i närheten till de återkommande laryngeala nerv med hjälp av en elektrisk nervstimulator. Denna nya teknik kan bli användbar för behandling av hästdjur återkommande larynx neuropati.
Återkommande larynx neuropati (RLN) vanligen drabbar hästar och kännetecknas av onormal andning ljud och motion intolerans. De återkommande laryngeala nerv visar lesioner av demyelinisering. Fördelen gäller stamceller för demyeliniserade nerver har påvisats i olika djurmodeller. Syftet med studien var att testa genomförbarheten och säkerheten för en peri-neuronala injektion av autologa muskel-derived mesenkymala stamceller till vänster återkommande larynx nerv hos friska hästar med hjälp av en elektrisk nervstimulator.
Muskel-derived stjälkar cell erhålls från fem friska Standardbred hästar genom provtagning 20 mg av muskelvävnad med en halvautomatisk 14 G biopsi nål från triceps muskeln. Rörelser i struphuvudet är övervakade via övre-luftvägarna video endoskopi. Den vänstra återkommande larynx nerven är närmade sig med en isolerad nervblockad nål. Nervstimulering används, börjar vid 2 mA och framgångsrika bortförandet av den vänstra arytenoid övervakas. Stimulering intensiteten minskas successivt. När en förlust av motoriska svaret observeras på 0,5 mA, 107 autolog muskel-derived stam celler injiceras. Två granskare, som är förblindade till den tidpunkten, Poäng larynx funktionen av hästarna före behandlingen och på dag 1, dag 7 och dag 28 efter injektion av cellerna. I en sjätte häst injiceras 1 mL 2% lidokain för att ytterligare bekräfta den korrekta positioneringen av nålen. Detta leder till en tillfällig förlamning i vänster arytenoid brosk.
Denna studie visar att de återkommande laryngeala nerv kan angripas med hjälp av en elektrisk nervstimulator och att elektrisk stimulering av nerven är väl tolereras av hästarna. Ingen ändring av larynx funktionen hos någon av hästarna efter injektion av stamcellerna. Ytterligare studier bör genomföras för att beskriva effekterna av en peri-neuronala injektion av autologa muskel-derived mesenkymala stamceller till hästar som lider av RLN.
RLN är en gemensam patologi av övre luftvägarna hos hästar kännetecknas av varierande grad av arytenoid förlamning. Vänster sida av struphuvudet påverkas oftast. Förekomsten av sjukdomen kan nå upp till 35% i vissa häst populationer. Även om flera hypoteser försökte förklara etiologin och patogenesen vid denna sjukdom, fortfarande den exakta orsaken till RLN osäker. Patologin beskrivs som en distala axonopathy av återkommande larynx nerv med lesioner av demyelinisering men även viss grad av remyelination. Denna axonopathy leder till denervering av inneboende laryngeala muskler och samtidig atrofi1,2. Denna patologi är ofta långsamt progredierande och kan leda till en total förlust av arytenoid bortförandet av den drabbade sida3.
Drabbade hästar avger onormala respiratoriska ljud under träning, och ibland Visa motion intolerans i svårare fall. Den definitiva diagnosen görs av den endoskopisk undersökningen på en icke-drogad stående häst där en partiell eller total förlust av larynx bortförande observeras1,2,4. För närvarande är den vanligaste behandlingen laryngoplasty (även känd som ”återkoppling”), som ibland förknippas med en ventriculo-cordectomy. Även om den övergripande framgången av dessa operationer anses lika bra till utmärkt5, är postoperativa komplikationer mycket vanliga. Den vanligaste komplikationen är en gradvis förlust av bortförandet. Barnett et al. 6 rapporterade en förlust av minst en grad av bortförande inom de första sex veckorna efter operationen i minst 76% av hästar. Andra komplikationer, såsom protes misslyckande, hosta och luftvägar kontaminering, finns också rapporterade5.
Mesenkymala stamceller (MSC) har varit en del av häst medicin i forskning och praktik för mer än ett decennium, även om visat studier på deras effektivitet är fortfarande knappa. De två mest exploaterade källorna till mesenkymala stamceller hos hästar är benmärgen och fettvävnad7. Både urvalsmetoder är relativt invasiva och leder inte alltid till ett tillräckligt antal celler. Nyligen, Ceusters et al. 7 beskrivs kulturen av stamceller som härrör från tvärstrimmig muskelvävnad, vilket erhålls genom en mindre invasiv microbiopsy teknik.
MSCs klarar av självförnyelse, egen produktion, multipotency och differentiering7,8. Deras förmåga att differentieras till alla mesoderm härstamningar av fett, ben, muskler och brosk är nu väl etablerad9. Dock under särskilda miljöförhållanden, kan de differentieras till icke-mesenkymala härstamningar som nervceller, astrocyter och myelinating celler i det perifera nervsystemet och ryggmärgen9,10. MSCs har redan använts i flera neuropati modeller10,11. Deras förmåga att migrera in i områden av degenererad nervös vävnad och att regenerera neurala celler har visats efter en systemisk och lokal administration11. Dessutom kan Schwann-liknande celler från MSCs rekryterar makrofager att ta bort cellulära skräp och utsöndrar neurotrofa faktorer som främjar axonal tillväxt och remyelination9.
Syftet med denna studie är att beskriva tekniken med en nerv stimulator-guidad injektion av muskel-derived autologa stamceller nära vänster återkommande larynx nerv hos friska hästar. Vanligtvis används en nervstimulator ansluten till en injektionsnål för electro-lokalisering av perifera nerver för att tillämpa lokalanestetika för att området12. En svag likström impuls levereras i närhet till nerven att inducera ett motoriskt svar. Förmågan att producera detta motoriskt svar beror på flera parametrar, såsom det ledande området av nålen, någon impedansen i vävnaden, den nuvarande tillämpas, pulslängd och avståndet från nålen till nerven. Nerv stimulator nålar är utformade för att ha en mycket restriktiv ledande området på spetsen av nålen, medan resten av nålen är isolerad. Denna design hjälper till att exakt lokalisera nerven. Moderna nervstimulatorer anpassas till varierande vävnad impedanser och leverera konstant strömstyrka på datorn. Dessutom de flesta maskiner använder pulslängd av 0,1 s, så att parametrarna som är avgörande är den nuvarande tillämpas och avståndet till nålen. Förhållandet mellan nål-till-nerv avståndet och nödvändig att producera ett motoriskt svar beskrivs i Coulombs lag: E = kQ/r; där E är krävs stimulering avgiften, k är Coulombs konstant, Q är minimala krävs stimulering avgiften och r är avståndet mellan de två elektroderna. I electro-lokaliseringen av nerver anses avståndet mellan de två elektroderna vara den nål-till-nerv avstånd12. Elektrisk laddning avleder efter regeln om omvänd torget av nål-till-nerv avstånd13. Klinisk praxis har visat att motorn nerv stimulering på 0,5 mA är starkt korrelerad till den framgångsrika nervblockad och att en förlust av motorisk signal vid lägre strömmar hindrar användaren från administrering av oavsiktlig intraneuronala injektioner. Syftet med denna studie är att testa genomförbarheten och säkerheten av denna teknik i ett begränsat antal hästar. Om genomförbarheten och säkerheten hos denna teknik bekräftas, kan den lätt överföras till drabbade hästar. «««Vidare, equine RLN kan tjäna som modell för degenerativa neuropati.
Det här protokollet beskriver en framgångsrik tillämpning av muskel-derived autologa stamceller på återkommande larynx nerverna i hästar med en nerv stimulator-guidad metod. Skörden av muskel microbiopsy preparatet, samt den isolering, kultur och karakterisering av stamcellerna, har beskrivits i detalj innan, medan injektion av dessa celler i närhet till en perifer nerv är ursprungliga. Electro-lokaliseringen av nerven med en elektrisk nervstimulator har tjänat för föreliggande studie och användes för att injicera mesenkymala stamceller i direkt närhet till de återkommande laryngeala nerv. Motoriska svaret övervakades av video endoskopi via nasofarynx. Om, under positionering av nålen, andra nerver stimuleras, var motsvarande rörelsen synlig på skärmen endoskopi. En framgångsrik stimulering av återkommande larynx nerv präglades av typiska bortförandet av arytenoid brosk. I en häst, var lokalbedövning injiceras för att framkalla en övergående förlamning av arytenoid muskeln. Även om lyckad implantation av cellerna i närhet till nerven inte har testats specifikt i den aktuella studien, bevisade electro-lokaliseringen av nerv och injektionen vid en låg ström att stamcellerna tillämpades nära nerven. Närheten av injectate till nerven visades ytterligare av en framgångsrik motor block som induceras av en injektion av lokalbedövning.
I de återstående fem hästarna, tiden från första stimulering tills framgångsrik stem cell injektionen varierade från 3 till 12 min. hästar var något drogad under förfarandet, vilket ökade deras överensstämmelse med elektrisk stimulering. Ingen av hästarna visade biverkningar när som helst, vilket indikerar att varaktigheten av stimulering kan förlängas vid behov att få bra nål positionering. En brant inlärningskurva förväntas observeras om operatören använder denna teknik regelbundet och i ett större antal hästar med varierande anatomi.
Hästar ofta lider RLN, som kännetecknas av olika grader av förlamning i vänster arytenoid brosk vilket leder till onormal andning ljud och utöva intolerans. En histologi av drabbade nerver avslöjar typiska lesioner av perifer neuropati16. Perifer neuropati är en term som används för att beskriva olika typer av perifer nerv skador leder till försämrad förnimmelser, rörelser eller organfunktioner. Orsakerna är mycket varierande och kan omfatta diabetes, näringsbrister, en behandling med specifika läkemedel, en traumatisk skada, ischemi eller en infektion, eller de kan vara idiopatisk. Oberoende av orsaken, perifera neuropatier dela gemensamma histopatologiska tecken, såsom Wallerian degeneration, distala axonopathy eller segmentell demyelinisering. Det har visat att administrering av mesenkymala stamceller till skadade perifera nerver kan vara fördelaktigt för deras föryngring. de bakomliggande mekanismerna är dock inte väl förstått. Traditionellt, tror vi att mesenkymala stamceller kommer endast differentieras till föräldraparets av fett, muskler, brosk och benvävnad, men under specifika förhållanden, de har visat att differentieras till myocyter17, astrocyter18 , och myelinating celler i perifert19 och centrala nervsystemet19. Under en in vitro- kultur, kommer att en exponering mot neuropeptider gynna differentiering av mesenkymala stamceller in i celler som uttrycker neuronala markörer21,22. Flera in-vivo studier har visat den positiva effekten av mesenkymala stamceller på nerv förnyelse och en funktionell återhämtning i råtta modeller av ischiasnerven skador10,23. Detta orsakas troligen av gynnsamma miljöförhållanden som bidrar till differentieringen av stamceller in vävnadsspecifika celler24. Framtida studier bör även undersöka denna teknik för förvaltning av pre differentierade celler i RLN-drabbade hästar.
Till bäst av vår kunskap är detta den första rapporten som beskriver användningen av en nervstimulator att lokalisera en perifer nerv för att injicera en specifik behandling in. Andra perifera nerver patologier i olika arter, såsom neuropatisk smärta, kan behandlas genom administrering av stamceller i närhet till den nerv25,26. Framtida studier bör testa effekten av denna teknik i kliniska patienter och undersöka risken för migration och differentiering av de injicerade cellerna potential.
The authors have nothing to disclose.
Studien har finansierats av Mont-le-Soie Equine Research Centre.
Detomidine (Domidine) | Dechra | sold through pharmacy | |
Lidocaine (Xylocaine) | Movianto | sold through pharmacy | |
TOF Watch S (Nerve stimulator) | Alsevia | 79950161 | |
TSK Starcut (Biopsy needle) | STSK laboratory | SAG – 14090C | |
Electrostimulation needle | Pajunk | 001185-79 | |
DMEM – F12 (culture medium) | Lonza | LO BE12-719F | |
Heat inactivated FBS | Life technologies | 10500 | |
Penicillin-streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
Amphotericin B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
Phospate buffered saline | Lonza | LO BE17-512F | |
24-multiwell dish | Corning | 3524 | |
Trypsin | Life technologies | 12604 | |
HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
NaCl | Sigma | S8776 | |
T-25cm² flasks | Nunclon | 136196 | |
T-175 cm² flasks | Nunclon | 178883 | |
Cryostore CS5 | Biolife solutions | 205373 |