Aqui, apresentamos um protocolo para injetar autólogas músculo-derivado células-tronco em proximidade com o nervo laríngeo recorrente, com a ajuda de um estimulador de nervo elétrico. Esta nova técnica pode tornar-se útil para o tratamento da neuropatia laríngeo recorrente equina.
Neuropatia laríngea recorrente (RLN) comumente afeta os cavalos e é caracterizada pela intolerância ao exercício e sons respiratória anormal. O nervo laríngeo recorrente mostra lesões de desmielinização. O benefício da aplicação de células-tronco para nervos desmielinizados tem sido demonstrado em vários modelos animais. O objetivo do estudo foi testar a viabilidade e a segurança de uma injeção peri-neuronal de autólogas músculo-derivados mesenquimais células-tronco para o nervo laríngeo recorrente esquerdo em cavalos saudáveis usando um estimulador de nervo elétrico.
Célula muscular-derivado de hastes são obtidos a partir de cinco cavalos de Standardbred saudáveis por amostragem 20 mg de tecido muscular com uma agulha de biopsia de 14 G semi automática do músculo tríceps. Os movimentos da laringe são monitorados através de vídeo endoscopia superior-das vias respiratórias. O nervo laríngeo recorrente esquerdo é abordado com uma agulha de bloqueio do nervo isolado. Estimulação do nervo é aplicada, começando com 2 mA e o rapto de sucesso da esquerda aritenoide é monitorado. A intensidade de estimulação é reduzida progressivamente. Quando uma perda de resposta da motor é observada em 0,5 mA, 107 autólogo músculo-derivado tronco células são injetadas. Dois examinadores, que são cegos a ponto de tempo, marcam a função da laringe dos cavalos antes do tratamento e no dia 1, dia 7 e dia 28, após a injeção das células. Em um cavalo sexto, 1 mL de lidocaína a 2% é injetado para confirmar o correto posicionamento da agulha. Isto leva a uma paralisia temporária da cartilagem aritenoide à esquerda.
Este estudo prova que o nervo laríngeo recorrente pode ser abordado com a ajuda de um estimulador de nervo elétrica e que a estimulação elétrica do nervo é bem tolerado pelos cavalos. Nenhuma modificação da função da laringe foi observada em qualquer um dos cavalos após a injeção de células tronco. Mais estudos devem ser conduzidos para descrever os efeitos de uma injeção peri-neuronal de autólogas músculo-derivados mesenquimais células-tronco para cavalos sofrendo RLN.
RLN é uma patologia comum das vias aéreas superiores em cavalos caracterizado por vários graus de paralisia aritenoide. O lado esquerdo da laringe é mais comumente afetado. A prevalência da doença pode chegar até 35% em determinadas populações de cavalo. Embora várias hipóteses tentaram explicar a etiologia e patogênese da doença, a causa exata da RLN permanece incerta. A patologia é descrita como um axonopathy distal do nervo laríngeo recorrente, com lesões de desmielinização, mas também algum grau de mielinogênese. Esta axonopathy leva a denervação dos músculos intrínsecos da laringe e atrofia concomitante1,2. Esta patologia é muitas vezes lentamente progressiva e pode levar a uma perda total do rapto aritenoide do lado afetado3.
Cavalos afetados emitem sons respiratórios anormais durante o exercício e, às vezes, mostram intolerância de exercício nos casos mais graves. O diagnóstico definitivo é feito pelo exame endoscópico em um cavalo não sedado em pé onde uma perda parcial ou total de abdução da laringe é observada1,2,4. Atualmente, o tratamento mais comum é laryngoplasty (também conhecido como “tie-back”), que às vezes está associada um ventriculo-cordectomia. Embora a taxa global de sucesso destas cirurgias é considerada tão bom para excelente5, complicações pós-operatórias são muito comuns. A complicação mais comum é uma perda gradual de abdução. Barnett et al . 6 relatou uma perda de pelo menos um grau de abdução dentro as primeiras seis semanas após a cirurgia em pelo menos 76% dos cavalos. Outras complicações, tais como falha de prótese, tossindo e contaminação das vias respiratórias, também são relatados5.
Células-tronco mesenquimais (MSCs) ter sido uma parte da medicina equina na pesquisa e na prática por mais de uma década, apesar de comprovada a estudos sobre a sua eficiência ainda são escassos. As duas fontes mais comumente exploradas de células-tronco mesenquimais adultas em cavalos são da medula óssea e tecido adiposo7. Ambas as técnicas de amostragem são relativamente invasivas e nem sempre leva a um número suficiente de células. Recentemente, Ceusters et al 7 descreveu a cultura de células-tronco derivadas de tecido muscular estriado, que é obtido por uma técnica menos invasiva de microbiopsy.
MSCs são capazes de auto-renovação, autogeração, multipotency e diferenciação7,8. Sua capacidade de se diferenciarem em todas as linhagens de mesoderme de cartilagem, osso, músculo e gordura está agora bem estabelecida9. No entanto, sob condições ambientais específicas, eles podem diferenciar em linhagens não-mesenquimais como neurônios, astrócitos e microambiental células do sistema nervoso periférico e da medula espinhal9,10. MSCs já foram usadas em neuropatia vários modelos10,11. Após uma administração sistêmica e local11, demonstrou-se sua capacidade de migrar para áreas do tecido nervoso degenerado e regenerar as células neurais. Além disso, as células de Schwann, como derivadas de MSCs podem recrutar os macrófagos para remover restos celulares e secretam fatores neurotróficos promover o crescimento axonal e mielinogênese9.
O objetivo deste estudo é descrever a técnica de uma injeção de guiadas estimulador de nervo de células-tronco autólogas músculo-derivado perto do nervo laríngeo recorrente esquerdo em cavalos saudáveis. Normalmente, um estimulador de nervo conectado a uma agulha de injeção é usado para electro-Localização de nervos periféricos a fim de aplicar anestésicos locais para aquela área12. Um impulso fraco corrente direta é fornecido na proximidade do nervo para induzir uma resposta motora. A capacidade de produzir esta resposta motora depende de vários parâmetros, tais como a área condutora da agulha, qualquer impedância do tecido, a corrente aplicada, a duração do pulso e a distância entre a agulha para o nervo. Agulhas do estimulador de nervo são projetadas para ter uma área condutora muito restritiva na ponta da agulha, enquanto o resto da agulha é isolado. Este projeto ajuda a localizar precisamente o nervo. Estimuladores de nervos modernos se adaptar a diferentes impedâncias de tecido e entregam a amperagem constante configurado na máquina. Além disso, a maioria das máquinas utilizam uma duração de pulso de 0,1 s, para que os parâmetros determinantes são a corrente aplicada e a distância para a agulha. A relação entre a distância de agulha-para-nervo e a corrente necessária para produzir uma resposta motora é descrita pela lei de Coulomb: E = kQ/r; onde E é a carga necessária estimulação, k é a constante de Coulomb, Q é a carga mínima necessária estimulação e r é a distância entre os dois eletrodos. A electro-Localização de nervos, a distância entre os dois eletrodos é considerada a distância de nervo agulha-para12. Carga elétrica dissipa-se seguindo a regra do quadrado inverso da distância de agulha-para-nervo13. Prática clínica tem mostrado que o motor do nervo estimulação em 0.5 mA é altamente correlacionada com o sucesso do bloqueio do nervo e que uma perda de sinal motor em correntes inferiores irá impedir o usuário de administrar injeções intraneuronal acidentais. O objetivo deste estudo é testar a viabilidade e a segurança desta técnica em um número limitado de cavalos. Se a viabilidade e a segurança dessa técnica são confirmadas, podem ser facilmente transferido para cavalos afetados. Além disso, equino RLN pode servir como modelo de neuropatia periférica degenerativa.
Este protocolo descreve o sucesso da aplicação de células-tronco autólogas músculo-derivado aos nervos laríngeos recorrentes em cavalos, usando uma abordagem orientada por estimulador de nervo. A colheita da amostra de microbiopsy o músculo, bem como o isolamento, cultura e caracterização das células tronco, têm sido descritos em detalhe antes, enquanto a injeção dessas células na proximidade de um nervo periférico é original. A electro-Localização do nervo com um estimulador de nervo elétrico tem servido para o presente estudo e foi usada para injetar células-tronco mesenquimais em proximidade directa com o nervo laríngeo recorrente. A resposta motora foi monitorada por vídeo endoscopia através da nasofaringe. Se, durante o processo de posicionamento da agulha, outros nervos foram estimulados, o movimento correspondente era visível na tela de endoscopia. Uma bem sucedida estimulação do nervo laríngeo recorrente caracterizava-se a abdução típica da cartilagem aritenoide. Em um cavalo, anestésico local foi injetado para induzir uma paralisia transitória da musculatura aritenoide. Embora a implantação bem sucedida das células na proximidade do nervo não foi testada especificamente no presente estudo, a electro-Localização do nervo e a injeção em uma baixa corrente provou que as células-tronco foram aplicadas perto do nervo. A proximidade da injectate ao nervo demonstrou-se ainda mais por um bem sucedido bloco motor induzido por uma injeção de anestésico local.
Os restantes cinco cavalos, o tempo desde a primeira estimulação até que a injeção de células-tronco bem sucedida variou de 3 a 12 min. cavalos foram ligeiramente sedados durante o procedimento, o que aumentou a sua conformidade com a estimulação elétrica. Nenhum dos cavalos apresentou reações adversas a qualquer momento, indicando que a duração da estimulação pode ser prolongada se necessário para obter a agulha bom posicionamento. Uma curva de aprendizagem deverá ser observado se o operador está usando esta técnica regularmente e em um maior número de cavalos com anatomia variada.
Cavalos, comumente, sofrem RLN, que é caracterizado por vários graus de paralisia da cartilagem aritenoide esquerda levando a sons respiratórios anormais e exercerem a intolerância. A histologia dos nervos afetados revela lesões típicas de neuropatia periférica16. Neuropatia periférica é um termo usado para descrever vários tipos de lesões de nervos periféricos, levando a sensações visuais, movimentos ou funções do órgão. As causas são altamente variáveis e podem incluir diabetes, deficiências de nutrientes, um tratamento com drogas específicas, uma lesão traumática, isquemia ou infecção, ou pode ser idiopática. Independente da causa, neuropatias periféricas compartilham sinais histopatológicos comuns, tais como degeneração Wallerian, axonopathy distal ou desmielinização segmentar. Tem sido demonstrado que a administração de células-tronco mesenquimais para danificado nervos periféricos pode ser benéfica para a sua regeneração; no entanto, os mecanismos subjacentes não são bem compreendidos. Tradicionalmente, nós acreditamos que as células-tronco mesenquimais só irá diferenciar em progenitores de adiposo, músculo, cartilagem e tecido ósseo, mas sob condições específicas, eles foram mostrados para diferenciar em miócitos17, astrócitos18 e microambiental células do sistema nervoso central19e periféricos19 . Durante uma cultura em vitro , uma exposição de neuropeptídeos favorecerá a diferenciação de células-tronco mesenquimais em células expressando marcadores neuronais21,22. Várias em vivo estudos têm demonstrado o efeito benéfico de células-tronco mesenquimais na regeneração do nervo e uma recuperação funcional em modelos do rato de lesão de nervo ciático10,23. Isso provavelmente é causado por condições ambientais favoráveis que contribuem para a diferenciação de células-tronco em células do tecido-específica24. Estudos futuros devem também investigar esta técnica de gestão de células pre-diferenciadas em cavalos RLN afetados.
O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que descreve o uso de um estimulador de nervo para localizar um nervo periférico para injetar um tratamento específico para ele. Outras patologias do nervo periférico em várias espécies, tais como dor neuropática, podem ser tratadas pela administração de células-tronco em proximidade com o nervo25,26. Estudos futuros devem testar o efeito desta técnica em pacientes clínicos e investigar o risco de migração e o potencial de diferenciação das células injetadas.
The authors have nothing to disclose.
O estudo foi financiado pelo centro de investigação Equine de Soie-le-Mont.
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