Évaluation fonctionnelle des voies olfactives chez les têtards de Xenopus vivant
Summary
Les têtards de Xenopus offrent une plate-forme unique pour étudier la fonction du système nerveux in vivo. Nous décrivons des méthodologies pour évaluer le traitement de l’information olfactive vie Xenopus larves dans des conditions normales d’élevage ou après une blessure.
Abstract
Les têtards de Xenopus offrent une plate-forme unique pour étudier la fonction du système nerveux. Ils offrent plusieurs avantages expérimentales, telles que l’accessibilité à nombreuses approches d’imagerie, des techniques électrophysiologiques et tests comportements. Le système olfactif de Xenopus têtard est particulièrement bien adapté pour étudier la fonction des synapses établis au cours du développement normal ou réformés après une blessure. Nous décrivons ici les méthodologies permettant d’évaluer le traitement de l’information olfactive dans la vie des larves de Xenopus . Nous exposons une combinaison de mesures in vivo des réponses de calcium présynaptique dans les glomérules du bulbe olfactif avec des essais de comportement olfactif guidée. Méthodes est cumulable avec la transection des nerfs olfactifs pour étudier le recâblage de la connectivité synaptique. Des expériences sont présentées à l’aide d’animaux sauvage et génétiquement modifiés exprimant des reporters de la GFP dans les cellules du système nerveux central. Application des méthodes décrites aux têtards génétiquement modifiés peut être utile pour démêler les bases moléculaires qui définissent le comportement de vertébrés.
Introduction
Les têtards de Xenopus constituent un excellent modèle animal pour étudier la fonction normale du système nerveux. Transparence, un génome entièrement séquencé1,2et l’accessibilité aux techniques chirurgicales, électrophysiologiques et d’imagerie sont des propriétés uniques des larves de Xenopus qui permettent d’étudier les fonctions neuronales in vivo3 . Quelques-unes des multiples possibilités expérimentales de ce modèle animal sont illustrés par les études approfondies réalisées têtard les systèmes sensoriels et moteurs4,5,6. Un circuit neuronal particulièrement bien adapté pour étudier plusieurs aspects de l’information au niveau des synapses est le Xenopus têtard système olfactif7. Tout d’abord, sa connectivité synaptique est bien définie : neurones récepteurs olfactifs (Orn) projettent vers le bulbe olfactif et établir des contacts synaptiques avec les dendrites des cellules mitrales/tuffeté dans les glomérules pour générer des cartes de l’odeur. Deuxièmement, son Orn continuellement générés par neurogenèse tout au long de la vie pour maintenir le fonctionnement des voies olfactives8. Et troisièmement, parce que le système olfactif montre une grande capacité régénératrice, Xenopus têtards sont en mesure de reformer entièrement leur bulbe olfactif après ablation9.
Dans cet article, nous décrivons les approches qui combinent l’imagerie des glomérules olfactifs chez les têtards vivant avec des expériences comportementales pour étudier la fonctionnalité des voies olfactives. Les méthodes détaillées ici ont été utilisées pour étudier la récupération fonctionnelle de la connectivité glomérulaire dans le bulbe olfactif après transection de nerf olfactif10. Données obtenues chez les têtards de Xenopus sont représentatifs des vertébrés comme traitement olfactif est évolutive conservée.
Les méthodes décrites sont illustrés à l’aide de X. tropicalis , mais elles peuvent être facilement implémentées dans X. laevis. Malgré la grande taille des adultes X. laevis, les deux espèces sont remarquablement semblables au cours des étapes de têtard. Les principales différences résident au niveau génomique. X. laevis affiche les pauvre traçabilité génétique, principalement déterminée par son génome allotétraploïde et longue durée de génération (environ 1 an). En revanche, x. tropicalis est plus favorable à des modifications génétiques en raison de sa durée d’une génération plus courte (5 à 8 mois) et le génome diploïde. Les expériences représentatives sont illustrées pour animaux sauvage et trois différentes lignées transgéniques : Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) et tubb2:GFP (X. laevis).
On envisagera les méthodologies décrites dans les travaux en cours aux côtés de la génétique progresse dans le domaine de Xenopus . La simplicité et la simple mise en œuvre des techniques présentées qui les rend particulièrement utile pour l’évaluation mutants déjà décrit11, ainsi que des lignes de Xenopus générés par CRISPR-Cas9 technologie12. Nous décrivons également une intervention chirurgicale permettant de transect des nerfs olfactifs qui peuvent être implémentées dans un laboratoire ayant accès aux têtards de Xenopus . Les approches utilisées pour évaluer les réponses de calcium présynaptique et comportement olfactif guidée nécessitent des équipements spécifiques, quoique disponible à un coût modéré. Méthodes sont présentées sous une forme simple de promouvoir leur utilisation dans des groupes de recherche et marquera-t-il le début les bases de tests plus complexes en mettant en œuvre des améliorations, ou par l’association à d’autres techniques, c’est-à-dire aux approches de, histologiques ou génétiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit les techniques qui sont utiles pour étudier la fonctionnalité des voies olfactives dans vie Xenopus têtards. Le protocole actuel est particulièrement utile pour les laboratoires qui travaillent ou ont accès aux Xenopus; Toutefois, il est également intéressant pour les chercheurs qui étudient les bases cellulaires et moléculaires de la réparation et la régénération neuronale. Résultats obtenus chez Xenopus est cumulable avec les données recueillies dans d’aut…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO ; SAF2015-63568-R) co-financé par le Fonds européen de développement régional (FEDER), de bourses de recherche concurrentielle de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, le Stephen W. fonds de bourses Kuffler, Laura et Arthur Colwin doué Summer Research Fellowship Fund , la bourse de Fischbach et le grand fonds de génération du laboratoire de Biologie Marine et la National Xenopus ressources RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts), où une partie de ce travail a été effectuée. Nous remercions également le programme CERCA / Generalitat de Catalunya d’appui institutionnel. A.L. est un camarade de Serra Húnter.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
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