시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과
Summary
우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.
Abstract
활성 연 접 신경 맨끝에서 시 냅 스 소포 주기를 및 endocytosis를 받 다. 재활용, 하는 동안 SV 막 횡단 단백질의 luminal 도메인 세포 표면에 노출 된다. 이러한 단백질 중 Synaptotagmin-1 (Syt1) 이다. 항 체를 한 번 문화 매체에 추가 하는 Syt1 luminal 도메인에 대 한 감독 엑 소 endocytotic 주기 동안 가져온 것입니다. 이 글귀 SV 재활용의 금액에 비례 하 고 면역 형광을 통해 정해질 수 있다. 여기, 우리가 교양된 hippocampal 신경의 이중 transfection Syt1 항 체 통풍 관 결합. (1) 연 접 사이트 재조합 연 접 마커 Synaptophysin의 식에 따라 지역화, (2) 결정 Syt1 통풍 관을 사용 하 여 그들의 기능 및 (3) 특성화 고 대상으로 우리와 관심, GFP Rogdi 단백질의 효과 수 있습니다.
Introduction
연 접 속성 변경, 시 냅 스가 소성 또는 시 냅 스 기능의 섭 동에 대응에서 하는 방법 시 냅 스 소포 재활용 공부 하는 것은 결정에 중요 하다. Synaptotagmin-1 (Syt1) 공부 항 체 이해는 SV 재활용의 양을 측정 한 방법을 제공 합니다. Syt1 Ca2 + 센서 역할을 신경 전달 물질1,2의 exocytotic 출시에 필요한 SV 관련 된 단백질 이다. 그것은 SV 외부 단자 세포질 도메인와 SV3내부 N 맨끝 luminal 도메인 막 횡단 단백질. Exocytosis, 동안 Syt1 luminal 도메인 외부 매체에 노출 된다. 이 외부 매체에 우리 endocytosis 동안 내 면 된다 세포질 도메인에 대하여 지시 하는 항 체를 추가 합니다. 이러한 항 체 중 미리 fluorophores 또는 이차 항 체4,,56,7immunostained와 함께 활용 될 수 있습니다. 결과 immunosignal의 형광 강도 SV 재활용의 양에 비례 합니다. 이 방법은6,8재활용 제정 및 도발은 유도 SV를 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
접시에 거의 모든 세포에 바이러스 중재 하는 유전자 이동 또는 세포의 작은 숫자의 스파스 transfection Syt1 이해 분석 실험을 수행할 수 있습니다. 우리의 방법은 칼슘 인산 염9를 사용 하 여 기본 hippocampal 신경의 스파스 더블 transfection 분석 결과 결합 합니다. 재조합 마커 단백질 presynapses에서 축적 하는 것으로 알려져 붙일 태그 Synaptophysin, 연 접 맨끝을 찾아서 우리의 단백질, Rogdi의 overexpress를 사용 합니다. 수 있습니다 테스트 여부 Rogdi 기능 synapses 대상과 SV 재활용에 영향을 줍니다. Rogdi 인코딩 유전자 초파리 돌연변이 장애인된 메모리10특징에 대 한 화면에서 원래 확인 되었다. 인간에서는, Rogdi 유전자에 있는 돌연변이 Kohlschütter Tönz 증후군 이라는 희귀 하 고 치명적인 질병을 일으킬. 치과 나 멜 기형, pharmacoresistant 간 질 및 정신 운동 지연;에서 고통 받는 환자 그러나, 유전자 제품의 subcellular 지 방화 하기 어려운11남아 있었다. 따라서, Syt1 이해 분석 결과 제공 기능 시 냅 스9에서 GFP 태그 Rogdi의 지역화에 대 한 주요 증거.
이 통풍 관 기술에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, SV 재활용 관찰할 수 있습니다 모두 실시간으로 라이브 이미징7,12, 수행 하 여 및 고정6,9 후 Syt1 형광 라벨의 형광 강도 측정 하 여. 또한, 여러 Syt1 항 체 변종 개발 되었습니다. 다음 표준 immunostaining 프로토콜, 고정 후 2 차 항 체로 표시 될 수 있습니다 태그 변종 그리고 이미 연결 된 형광 라벨와 사전 활용된 이체 있다. 마지막으로, 형광 항 체 기반으로 사용할 수 있는 상용 보조 또는 활용 된 염료의 큰 선택 때문에 유리 하다.
때 고정 하 고 immunostaining 신경, 그것은 또한 추가적인 단백질을 위한 얼룩 colocalization 분석을 수행 하. 이 그들이 있는 재활용 SVs에 관하여 결정을 도울 수 있다. 형광 라벨의 강도 SV 재활용의 양 직접 측정. 또한, 항 체는 선택적으로 포함 하는 Syt1 구조, 높은 특이성 및 작은 배경 형광4결과로 라벨. 다른 자극 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다, 같은 도발은 버퍼 또는 전기 자극 프로토콜9,12,,1314. 그러나, 기초 SV 재활용 신경 문화15자극 없이 측정할 수 있습니다.
우리의 방법은 구체적으로 고정 후 이차 항 체 immunolabeling와 더블 페 뉴런에서 Syt1 항 체 이해를 해결합니다. 그러나, 우리는 시청자에 게 프로토콜 특정 요구에 적응 하는 기회를 우리의 논의에 분석 결과의 모든 일상적으로 사용 된 이체를 참조 하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
정기적으로 재활용 시 냅 스 소포 (SV)를 공부 하는 데 사용 하는 3 개의 분석을 확인 하 고 있습니다. 처음 두의 사용을 포함 한) 형광 styryl FM1-43 (이 막에 통합 하 고 세포로 endocytosis, 동안 채택 exocytosis 후 해제 됩니다); 같은 염료 그리고 b) 붙일 재조합 SV 단백질 (, overexpression, 따라 배치할 재활용 기계에 통합) 태그. 연결 된 fluorophores 그들의 형광은 pH에 따라 변경는 SV의 산 성 내부와 extracellular 매?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 전문가 기술 지원을 위한 Irmgard와 이즈를 감사합니다. 이 작품은 나노미터 범위에 현미경 검사 법에 대 한 우수성의 클러스터 (CNMPB, b 1-7, T.D.) 뇌의 분자 생리학을 통해 DFG에 의해 지원 되었다.
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
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