Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten
Summary
We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.
Abstract
Bij actieve presynaptische zenuw terminals ondergaan synaptische vesikels cycli van exo- en endocytose. Tijdens de recycling, worden de luminal domeinen van SV transmembraan eiwitten op het celoppervlak blootgesteld. Een van deze proteïnen is Synaptotagmin-1 (Syt1). Een antilichaam gericht tegen het luminal domein van Syt1, eenmaal is toegevoegd aan het kweekmedium, wordt tijdens de exo-endocytotic cyclus in beslag genomen. Deze opname is evenredig aan het bedrag van SV recycling en kan worden gekwantificeerd door immunofluorescentie. Hier combineren we Syt1 antilichaam opname met dubbele transfectie van gekweekte hippocampal neuronen. Hierdoor is ons (1) lokaliseren presynaptische sites die zijn gebaseerd op expressie van recombinante presynaptische markering Synaptophysin, (2) het bepalen van hun functionaliteit met behulp van Syt1 opname en (3) karakteriseren de doelgerichtheid en de gevolgen van een proteïne van belang, GFP-Rogdi.
Introduction
Bestuderen van synaptic vesikel recycling is belangrijk bij het bepalen hoe presynaptische eigenschappen, tijdens de Synaptische plasticiteit of in reactie op verstoring van synaptische functie wijzigen. Synaptotagmin-1 (Syt1) bestuderen biedt antilichaam opname een methode voor het meten van de hoeveelheid SV recycling. Syt1 is een SV-geassocieerde proteïne dat fungeert als een Ca2 + sensor en is noodzakelijk voor de exocytotic release van de neurotransmitter1,2. Het is een transmembraan eiwit met een C-terminal cytoplasmatische domein buiten de SV en een N-terminal luminal domein binnen de SV-3. Tijdens exocytose, wordt het luminal domein van Syt1 blootgesteld aan het externe medium. We toevoegen naar deze externe medium, antilichamen gericht tegen de cytoplasmatische domein, waardoor het geëigd tijdens endocytose maken wordt. Deze antilichamen kunnen dat hetzij vooraf geconjugeerd met fluorophores of immunostained met secundaire antilichamen4,,5,,6,7. De intensiteit van de fluorescentie van de resulterende immunosignal is evenredig aan het bedrag van SV recycling. Deze benadering kan worden gebruikt om te bepalen zowel de constitutieve en de depolarisatie-geïnduceerde SV recycling6,8.
Syt1 opname testen kunnen worden uitgevoerd na virus-gemedieerde genoverdracht op vrijwel alle cellen in de schotel of na sparse transfectie van een klein aantal cellen. Onze methode combineert de bepaling met sparse dubbele transfectie van primaire hippocampal neuronen met calciumfosfaat9. We gebruiken een recombinant marker eiwit bekend te accumuleren op presynapses, fluorescently tagged Synaptophysin, zoek presynaptische terminals en overexpress onze proteïne van belang, Rogdi. Daardoor kunnen we om te testen of Rogdi doelstellingen functionele synapses en treft SV recycling. Het gen Rogdi codering was het oorspronkelijk geïdentificeerd in een scherm voor Drosophila mutanten gekenmerkt door verminderde geheugen10. Mutaties in het Rogdi-gen veroorzaken bij de mens, een zeldzame en verwoestende ziekte heet het syndroom van Kohlschütter-Tönz. Patiënten lijden aan tandheelkundige glazuur misvormingen, pharmacoresistant epilepsie en psychomotorische vertraging; de subcellular localisatie van het gen product bleef echter ongrijpbare11. Aldus, is de bepaling van de opname Syt1 vastgestelde belangrijkste bewijs voor de lokalisatie van GFP-gelabeld Rogdi bij functionele synapsen9.
Deze opname-techniek heeft meerdere voordelen. Eerst, SV recycling waarneembaar zowel in real-time als door het uitvoeren van levende imaging7,12, en na fixatie6,9 door het meten van de intensiteit van de fluorescentie van het label van de fluorescentie Syt1. Bovendien hebben verschillende varianten van Syt1 antilichamen ontwikkeld. Er zijn niet-gelabelde varianten die kunnen gelabeld zijn met een secundair antilichaam dat een standaard immunokleuring protocol na fixatie, en vooraf geconjugeerd varianten met een reeds bevestigd etiket van fluorescentie. Tenslotte is de fluorescentie antilichamen gebaseerde voordelige als gevolg van de grote selectie van verkrijgbare secundaire of geconjugeerd kleurstoffen die kunnen worden gebruikt.
Wanneer vaststelling en immunokleuring de neuronen, het is ook mogelijk om de vlek voor extra eiwitten en colocalization analyses uit te voeren. Dit kan helpen bepalen waar zij zich bevinden met betrekking tot recycling SVs. De intensiteit van de fluorescentie-label is de directe maat voor de hoeveelheid SV recycling. Bovendien, label de antilichamen selectief Syt1-bevattende structuren, wat resulteert in hoge specificiteit en weinig achtergrond fluorescentie4. Stimulatie van de verschillende protocollen kunnen ook worden gebruikt, zoals de depolarisatie buffers of elektrische stimulatie protocollen9,12,13,14. Basale SV recycling kan echter worden gemeten zonder het stimuleren van de neuronale culturen15.
Onze werkwijze richt zich specifiek Syt1 antilichaam opname in neuronen met secundair antilichaam immunolabeling dubbel-transfected na fixatie. Echter, verwijzen we naar alle routinematig gebruikte varianten van de bepaling in onze discussie kijkers de gelegenheid te geven zich aan te passen van het protocol aan specifieke behoeften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn drie testen routinematig gebruikt bij het bestuderen van synaptic Vesikel (SV) recycling. De eerste twee omvatten het gebruik van een) fluorescerende styryl kleurstoffen zoals FM1-43 (die nemen in membranen, bij endocytose in organellen omhoog worden genomen en worden uitgebracht na exocytose); en b) fluorescently gelabeld recombinante eiwitten van SV (die op overexpressie, integreren in de eiwithoudende recycling machines). Als de bijgevoegde fluorophores hun fluorescentie afhankelijk van de pH wijzigen, kunnen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Irmgard Weiss voor deskundige technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de DFG via het Cluster of excellence voor microscopie op het nanometer bereik en moleculaire fysiologie van de hersenen (CNMPB, B1-7, T.D.).
Materials
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| BSA | Sigma | A7030-50g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306-100g | |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | ||
| dH2O | Invitrogen | 15230 | |
| DABCO | Merck | 8.03456.0100 | |
| donkey anti mouse Alexa 647 | Jackson-Immunoresearch | 715605151 | antibody |
| DMEM | Invitrogen | 41966 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| tube (50 mL) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| FBS superior | BiochromAG | S0615 | |
| Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170 | |
| HEPES | Sigma | H4034-500g | |
| Hera Cell 150 (Inkubator) | ThermoElectron Corporation | ||
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541-500g | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030 | |
| MgCl2 | Honeywell | M0250-500g | |
| microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| OpenView Experiment Analysis Application | Free software, see comments | written by Noam E. Ziv, Technion – Israel Institute of Technology, Haifa, Israel | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Optimem | Invitrogen | 31985 | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| safety hood | ThermoElectron | Serial No. 40649111 | |
| Sucrose | neoFroxx | 1104kg001 | |
| Synaptotagmin1 | Synaptic Systems | 105311 | mouse monoclonal; clone 604.2 |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Water bath | GFL | 1004 | |
| Zeiss Observer. Z1 | Zeiss | ||
References
- Koh, T., Bellen, H. J. Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends in Neurosciences. 26, 413-422 (2003).
- Chapman, E. R. How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release. Annual Review of Biochemistry. 77, 615-641 (2008).
- Perin, M. S., et al. Structural and Functional Conservation of Synaptotagmin (p65) in Drosophila and Humans. Journal of Biological Chemistry. 266, 615-622 (1991).
- Matteoli, M., Takei, K., Perrin, M. S., Südhof, T. C., De Camilli, P. Exo-endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in Developing Processes of Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Cell Biology. 117, 849-861 (1992).
- Ko, J., et al. Neuroligin-1 performs neurexin-dependent and neurexin-independent functions in synapse validation. The EMBO Journal. 28, 3244-3255 (2009).
- Shinoda, Y., et al. BDNF enhances spontaneous and activity-dependent neurotransmitter release at excitatory terminals but not at inhibitory terminals in hippocampal neurons. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 27 (2014).
- Ivanova, D., et al. Synaptic activity controls localization and function of CtBP 1 via binding to Bassoon and Piccolo. The EMBO Journal. 34, 1056-1077 (2015).
- Crawford, D. C., Ramirez, D. M. O., Trauterman, B., Monteggia, L. M., Kavalali, E. T. Selective molecular impairment of spontaneous neurotransmission modulates synaptic efficacy. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Riemann, D., Wallrafen, R., Dresbach, T. The Kohlschütter-Tönz syndrome associated gene Rogdi encodes a novel presynaptic protein. Scientific Reports. 7, (2017).
- Kim, M., et al. Rogdi Defines GABAergic Control of a Wake-promoting Dopaminergic Pathway to Sustain Sleep in Drosophila. Scientific Reports. 7, 1-14 (2017).
- Schossig, A., Wolf, N. I., Kapferer, I., Kohlschütter, A., Zschocke, J. Epileptic encephalopathy and amelogenesis imperfecta: Kohlschütter-Tönz syndrome. Euopean Journal of Medical Genetics. 55, 319-322 (2012).
- Kraszewski, K., et al. Synaptic Vesicle Dynamics in Living Cultured Hippocampal Neurons Visualized with CY3-Conjugated Antibodies Directed against the Lumenal Domain of Synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15, 4328-4342 (1995).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Petkova, A., Goedecke, N., Korte, M., Dresbach, T. Neuroligins mediate presynaptic maturation through brain-derived neurotrophic factor signaling. bioRxiv. , 262246 (2018).
- Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. European Journal of Neuroscience. 38, 3146-3158 (2013).
- Dresbach, T., et al. Functional regions of the presynaptic cytomatrix protein Bassoon: Significance for synaptic targeting and cytomatrix anchoring. Molecular and Cellular Neuroscience. 23, 279-291 (2003).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. Journal of Visualized Experiments. (65), 4-9 (2012).
- Tsuriel, S., et al. Local sharing as a predominant determinant of synaptic matrix molecular dynamics. PLOS Biology. 4, 1572-1587 (2006).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-10 (2014).
- Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), 1-8 (2017).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nature Neuroscience. 17, 10-16 (2014).
- Opazo, F., et al. Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic. 11, 800-812 (2010).
- Wollebo, H. S., Woldemichaele, B., White, M. K. Lentiviral transduction of neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1078, 141-146 (2013).
- Yang, X., Kaeser-Woo, Y. J., Pang, Z. P., Xu, W., Südhof, T. C. Complexin Clamps Asynchronous Release by Blocking a Secondary Ca2+ Sensor via Its Accessory α Helix. Neuron. 68, 907-920 (2010).
- Wittenmayer, N., et al. Postsynaptic Neuroligin1 regulates presynaptic maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13564-13569 (2009).
- Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. Extensive Remodeling of the Presynaptic Cytomatrix upon Homeostatic Adaptation to Network Activity Silencing. Journal of Neuroscience. 31, 10189-10200 (2011).
- Kraszewski, K., Daniell, L., Mundigl, O., De Camilli, P. Mobility of synaptic vesicles in nerve endings monitored by recovery from photobleaching of synaptic vesicle-associated fluorescence. Journal of Neuroscience. 16, 5905-5913 (1996).
- Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nature Neuroscience. 13, 1451-1453 (2010).
- Han, W., et al. N-Glycosylation Is Essential for Vesicular Targeting of Synaptotagmin 1. Neuron. 41, 85-99 (2004).
- Kwon, S. E., Chapman, E. R. Glycosylation is dispensable for sorting of synaptotagmin 1 but is critical for targeting of SV2 and synaptophysin to recycling synaptic vesicles. Journal of Biological Chemistry. 287, 35658-35668 (2012).
- Afuwape, O. A. T., Wasser, C. R., Schikorski, T., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle pool-specific modification of neurotransmitter release by intravesicular free radical generation. The Journal of Physiology. 595, 1223-1238 (2017).
- Sara, Y., Virmani, T., Deák, F., Liu, X., Kavalali, E. T. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
- Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nature Neuroscience. 13, 1454-1456 (2010).
- Bacci, A., et al. Chronic blockade of glutamate receptors enhances presynaptic release and downregulates the interaction between synaptophysin-synaptobrevin-vesicle-associated membrane protein 2. Journal of Neuroscience. 21, 6588-6596 (2001).
- Piccoli, G., et al. LRRK2 Controls Synaptic Vesicle Storage and Mobilization within the Recycling Pool. Journal of Neuroscience. 31, 2225-2237 (2011).
- Tracy, T. E., Yan, J. J., Chen, L. Acute knockdown of AMPA receptors reveals a trans-synaptic signal for presynaptic maturation. The EMBO Journal. 30, 1577-1592 (2011).
- Truckenbrdot, S., Viplav, A., Jaehne, S., Vogts, A., Denker, A., Wildhagen, H., Fornasiero, E. F., Rizzoli, S. O. Ageing synaptic vesicles are inactivated by contamination with SNAP25. bioRxiv. , 172239 (2017).
