Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen
Summary
Hier gebruiken we bioluminescente, X-ray, en het positron-emissie tomografie/berekend tomography imaging te bestuderen hoe remmende mTOR activiteit beïnvloedt het beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in een xenograft model. Dit zorgt voor fysiologisch relevante, niet-invasieve en multimodale analyses van het effect van de anti-myeloma van therapieën gericht op beenmerg-geaccepteerd myeloma tumoren in vivo.
Abstract
Multipel myeloom (MM) tumoren in het beenmerg (BM) engraft en hun overleving en progressie zijn afhankelijk van complexe moleculaire en cellulaire interacties die bestaan binnen deze communicatie. Nog kan de BM-communicatie niet gemakkelijk gerepliceerde in vitro, die potentieel de fysiologische relevantie van vele experimentele modellen die in vitro en ex vivo beperkt . Deze problemen kunnen worden opgelost door gebruik te maken van een xenograft model in welke luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cellen zal specifiek engraft in het skelet van de muis. Als deze muizen worden gegeven de geschikt substraat, kan D-luciferine, de effecten van therapie op de tumorgroei en overleving worden geanalyseerd door het meten van veranderingen in de bioluminescente beelden (BLI) geproduceerd door de tumoren in vivo. Deze BLI-gegevens gecombineerd met positronisch-emissie tomografie/computationele tomografie (PET/CT) analyse met behulp van de metabole marker 2-deoxy – 2-(18F) fluoro-D-glucose (18F-FDG) wordt gebruikt voor het controleren van wijzigingen in de tumor metabolisme na verloop van tijd. Deze beeldvormende platforms kunnen voor meerdere noninvasive metingen binnen de tumor/BM-communicatie.
Introduction
MM is een ongeneeslijke ziekte opgebouwd uit kwaadaardige plasma B-cellen die infiltreren in de BM en bot vernietiging, bloedarmoede, nierfunctie en infectie veroorzaken. MM van 10% – 15% van alle hematologische maligniteiten1 maakt en is de meest voorkomende kanker te betrekken de skeleton2. De ontwikkeling van MM vloeit voort uit de oncogene transformatie van langlevende plasmacellen die gevestigd zijn in de germinal centra van lymfoïde weefsels voordat uiteindelijk homing naar de BM3. De BM wordt gekenmerkt door zeer heterogene nissen; met inbegrip van divers en kritische cellulaire componenten, regio’s van lage pO2 (hypoxie), uitgebreide vascularisatie, complexe extracellulaire matrices en cytokine en groeifactor netwerken, die allemaal aan MM tumorgenesis4 bijdragen. Dus, zou de ontwikkeling van een gedissemineerde MM xenograft model gekenmerkt door tumoren die strikt worden geaccepteerd in de BM, een zeer krachtig en klinisch relevante hulpprogramma voor studie van MM pathologie in vivo5,6. Echter kunnen talrijke technische hindernissen beperken de doeltreffendheid van de meeste modellen van de xenograft, waardoor ze kostbaar en moeilijk toe te passen. Dit omvat problemen in verband met consistente en reproduceerbare tumor engraftment binnen de niche van de BM, een verlengde tijd aan de ontwikkeling van de tumor, en beperkingen in de mogelijkheid om rechtstreeks observeren en veranderingen van tumor groei/survival zonder te hoeven meten offeren muizen in de loop van het experiment7,8.
Dit protocol maakt gebruik van een gemodificeerd xenograft-model dat aanvankelijk werd ontwikkeld door Miyakawa et al. 9, waarin een intraveneuze (IV) uitdaging met myeloma cellen resulteert in “gedissemineerde” tumoren die consequent en reproducibly in de BM van NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) muizen10 engraft. De visualisatie in situ van deze tumoren wordt bereikt door de stabiele transfectie van de 8226 menselijke MM cellijn met een allel LUC en serieel het meten van de veranderingen in de BLI geproduceerd door deze werk tumor cellen6. Nog belangrijker is, kan dit model te gebruiken diverse andere LUC-uiten menselijke MM cellijnen (bijvoorbeeld, U266 en OPM2) met een gelijkaardige neiging naar specifiek engraft in het skelet van de muizen NOG worden uitgebreid. De identificatie van de tumoren door bioluminescente beeldvorming van de muizen wordt gevolgd door het meten van de opname van radiofarmaceutische sondes (zoals 18F-FDG) door PET/CT. samen, zorgt dit voor extra karakterisering van kritische biochemische trajecten (d.w.z., veranderingen in het metabolisme, veranderingen in hypoxie en de inductie van apoptosis) binnen de tumor/BM-communicatie. De belangrijkste troeven van dit model kunnen worden benadrukt door de beschikbaarheid van een breed scala van radiolabeled, bioluminescente en fluorescerende sondes en markeringen die kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van MM progressie en pathologie in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks een verscheidenheid van preklinische xenograft modellen van MM6,9,11,12,13blijft de mogelijkheid te bestuderen van de tumor/BM interacties communicatie in het BM moeilijk 14. de hier beschreven technieken zorgen voor de snelle en reproduceerbaar engraftment van 8226-LUC tumoren cellen in het skelet voor NOG muizen.
<p class=…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een grant1I01BX001532 VA VERDIENSTE van het VS departement van veteranen zaken biomedische laboratoriumonderzoek en ontwikkeling Service (BLRDS) te P.F., E.C. erkent steun van de () VA Clinical Science R & D-Service Merit Award I01CX001388) en VA revalidatie R & D Service (Merit Award I01RX002604). Verdere steun kwam uit een UCLA faculteit zaad subsidie aan J.K. Deze inhoud noodzakelijkerwijs niet de visie van de ons Department of Veterans Affairs of de regering van de VS.
Materials
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
- Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
- Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135 (2012).
- Anderson, K. C., Carrasco, R. D. Pathogenesis of Myeloma. Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).
- Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
- Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025 (2013).
- Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
- Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
- Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
- Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
- Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
- Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
- Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641 (2013).
- Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
- Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
- Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
- Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).
