La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar y caracterizar la estructura, potencia olfativa y respuesta comportamiento de compuestos de feromonas putativos de lampreas de mar.
Abstract
Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque iterativo que utiliza los resultados de pruebas biológicas fisiológicas y de comportamiento para el aislamiento e identificación de un compuesto activo de la feromona. Este método ha dado como resultado la acertada caracterización de las señales químicas que actúan como feromonas en una amplia gama de especies animales. Lampreas del mar dependen de olfato para detectar las feromonas que median las respuestas conductuales o fisiológicas. Utilizamos este conocimiento de la biología de peces para afirmar las funciones de las supuestas feromonas y para el aislamiento e identificación de los componentes de la feromona activa. Cromatografía se utiliza para extraer, concentrar y separar compuestos del agua condicionado. Electro-olfactogram (EOG) las grabaciones se llevan a cabo para determinar qué fracciones provocan respuestas olfativas. Ensayos conductuales laberinto dos opción entonces se utilizan para determinar si cualquiera de las fracciones los también son su comportamiento activo e inducen una preferencia. Métodos espectroscópicos y espectrométricos proporcionan el peso molecular e información estructural para ayudar en la aclaración de la estructura. La bioactividad de los puros se confirma con análisis de comportamiento y EOG. Las respuestas conductuales observadas en el laberinto, en definitiva, deberán validarse en un ambiente de campo para confirmar su función en un entorno natural de la corriente. Estas pruebas biológicas desempeñan un papel dual para 1) guiar el proceso de fraccionamiento y 2) confirmar y definir con mayor precisión la bioactividad de componentes aislados. Aquí, Divulgamos los resultados representativos de una identificación de la feromona de lamprea marina que ejemplifican la utilidad del enfoque fraccionamiento guiado por bioensayo. La identificación de las feromonas de la lamprea marina es particularmente importante porque una modulación de su sistema de comunicación de feromona es entre las opciones consideradas para el control de la lamprea de mar invasiva en el Laurentian Great Lakes. Este método se puede adaptar fácilmente para caracterizar la comunicación química en una amplia gama de taxa y arrojar luz sobre ecología química transmitidas por el agua.
Introduction
Las feromonas son señales químicas específicas por personas que les ayudan a localizar fuentes de alimento, detectar depredadores y mediar las interacciones sociales de sus congéneres1. Comunicación de feromonas en insectos ha sido bien estudiado2; sin embargo, la identificación química y función biológica de las feromonas vertebradas acuáticas no han sido estudiados tan extensamente. Conocimiento de la identidad y función de las feromonas liberado pueden aplicarse para facilitar la recuperación de especies amenazadas3,4 o el control de plagas especies5,6. La aplicación de estas técnicas requiere el aislamiento y la caracterización de los componentes bioactivos de la feromona.
Identificación de la feromona es una rama de la química de productos naturales. Progreso en la investigación de la feromona ha sido parcialmente limitada debido a la naturaleza de las moléculas de feromona se. Las feromonas son a menudo inestables y liberado en pequeñas cantidades, y existen sólo unas pocas técnicas de muestreo para detectar cantidades diminutas de volátiles7,8 o compuestos solubles en agua9. Enfoques para identificar las feromonas incluyen 1) una proyección específica de compuestos conocidos, 2) metabolómica y fraccionamiento 3) guiado por bioensayo. Una proyección específica de compuestos conocidos pruebas disponibles comercialmente los subproductos metabólicos de procesos fisiológicos que se presumen para funcionar como las feromonas. Este enfoque limita porque los investigadores sólo pueden probar compuestos conocidos y disponibles. Sin embargo, ha resultado en la identificación acertada de las hormonas sexuales en los peces de colores que funcionan como feromonas10,11,12. Metabolómica es un segundo enfoque de identificación de la feromona que distingue productos metabólicos posibles de molécula pequeña dentro de un sistema biológico13. Una comparación de los perfiles metabólicos de los dos grupos (es decir, un activo versus un extracto inactivo) permite la identificación de un perfil metabólico potencial de que el metabolito es purificado, es dilucidar la estructura y la bioactividad es confirmado14. Efectos aditivos o sinérgicos de complejas formulaciones de mezclas específicas suelen detectarse con metabolómica debido a metabolitos son considerados juntos en lugar de como una serie de fracciones13. Sin embargo, la aplicación de la metabolómica se basa en la disponibilidad de referencias sintéticas porque los datos resultantes no facilitan la elucidación de estructuras novedosas.
Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque integrado, iterativo que abarca dos campos: química y biología. Este enfoque utiliza los resultados de pruebas biológicas fisiológicas y de comportamiento para el aislamiento e identificación de un compuesto activo de la feromona. Un extracto crudo es fraccionado por una propiedad química (es decir, tamaño molecular, polaridad, etc.) y probado con grabaciones de electro-olfactogram (EOG) o en un bioensayo. Los componentes bioactivos se proyectan hacia fuera repitiendo estos pasos de fraccionamiento y EOGs o pruebas biológicas. Las estructuras de compuestos activos puros se esclareció por métodos espectroscópicos y espectrométricos, que el peso molecular e información estructural para producir una plantilla del compuesto a ser sintetizados. Fraccionamiento guiado por bioensayo puede producir diversos metabolitos y potencialmente nuevas feromonas con esqueletos química únicas que no puede predecirse desde las vías biosintéticas.
Aquí, describimos el protocolo de fraccionamiento guiado por bioensayo utilizado para aislar y caracterizar la actividad biológica de compuestos de feromonas sexo masculino lamprea de mar. La lamprea marina (Petromyzon marinus) es un modelo vertebrado ideal para estudiar comunicación feromonas porque estos peces dependen en gran medida la detección olfativa de señales químicas para mediar su historia de vida anádromo conformada de tres etapas distintas: larvas, juveniles y adultos. Larvas de lamprea marina madriguera en el sedimento de las corrientes de agua dulce sufren una drástica metamorfosis y transforman en juveniles que migran a un lago o un océano donde que parasitan a peces de gran acogida. Después de la extracción de los pescados del anfitrión, los adultos migran hacia arroyos de desove, guiado por las feromonas migratorias publicadas por larvas de corriente residente15,16,17,18,19 . Los machos maduros ascienden para el desove, liberan una feromona sexual multicomponente para atraer a compañeros, aparecen intermitentemente durante aproximadamente una semana y luego mueren15,20. La identificación de las feromonas de la lamprea marina es importante porque una modulación del sistema de comunicación de feromona es entre las opciones consideradas para el control de las lampreas de mar invasivas en el Laurentian Great Lakes21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Peces viven en un mundo químico completo de compuestos aún por identificarse. Fraccionamiento guiado por bioensayos se ha demostrado esencial para identificar y caracterizar moléculas bioactivas que median muchas interacciones químicas, como los observados en salmón masu31, elefantes asiáticos32y lampreas de mar33, 34,35. Fraccionamiento guiado por bioensayo es un enfoque ef…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Estados Unidos geológico estudio Hammond Bay estación biológica para el uso de sus instalaciones de investigación y el personal del U.S. Fish y Wildlife Service y pesca y océanos de Canadá para proporcionar lampreas de mar. Esta investigación fue apoyada por las subvenciones de la Comisión de pesca de los grandes lagos a Li Weiming y Ke Li.
Materials
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
References
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