במבחנה הבידול של העכבר גורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-הפקת תאי T Helper (THGM)
Summary
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להבדיל מאתר granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) תאים מתאי CD4 + T נאיביים, כולל בידוד תאי CD4 + T נאיבי, הבידול של THGM, ו- ניתוח של תאים THGM. בשיטה זו ניתן ליישם לימודי ההוראה ותפקוד תאי THGM.
Abstract
הגורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-ייצור תא T מסייע (THGM) היא תת-קבוצה תא מסייע T שזוהה בעיקר מפריש GM-CSF מבלי לייצר אינטרפרון (IFN) וγ או אינטרלוקין (IL)-17, נמצא לשחק תפקיד חיוני neuroinflammation אוטואימונית. שיטה של בידוד של תמים CD4 + T תאים מתא בודד השעיה של splenocytes ויצירת תא THGM מתאי CD4 + T נאיביים יהיה טכניקה שימושית במחקר של חסינות T תאית ומחלות אוטואימוניות. כאן נתאר שיטת מבדיל בין בעכבר נאיבי CD4 + T תאים לתאי THGM קידום על ידי IL-7. התוצאה של הבידול הוערכה על ידי הניתוח של הביטוי ציטוקינים באמצעות טכניקות שונות, כולל ציטוקין תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), ו מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). כ-55% של התאים באמצעות פרוטוקול בידול THGM כפי שמתואר כאן, הביע GM-CSF עם ביטוי מינימלי של IFNα או IL-17. הביטוי העיקרי של GM-CSF על-ידי תאי THGM אושר עוד יותר על ידי הניתוח של הביטוי של GM-CSF, IFNα ו- IL-17 ברמות ה-mRNA וגם חלבון. לכן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להבדיל תמים CD4 + T תאים THGM תאי במבחנה, אשר יהיה שימושי במחקר של ביולוגיה של התא THGM.
Introduction
תאי CD4 + T helper (TH) הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, יש תפקיד מכריע ההגנה מארח נגד חיידקים פתוגנים, מעקב סרטן, מחלת חיסון עצמי1,2,3. בעת הפעלת קולטן (TCR) תא T, תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מובחן TH1, TH2, TH 17, כתוצאה מתקנות או תאי T (Treg) תחת ההשפעה של ציטוקינים שונים milieus2,4, 5. לאחרונה, ערכה חדשה של תאי TH , המייצרת בעיקר GM-CSF, היה מזוהה, בשם THGM6. הבידול בתאי THGM מונעת על ידי IL-7 באמצעות הפעלת אות מתמר activator של שעתוק 5 (STAT5). תאים אלה אקספרס כמות גדולה של GM-CSF תוך ביטוי נמוך של אחרים TH-תא החתימה ציטוקינים כגון IFNγ ו- IL-176. GM-CSF נמצאה לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של CD4 + T תאית neuroinflammation7,8. בהשוואה ל IFNγ – או איל-17-לבטא autoreactive T תאים, GM-CSF-הבעת ‘ T תאים שהועברו אל פראי-סוג עכברים (WT) גרם של תחילת המחלה מוקדם יותר וחומרת המחלה גבוהה יותר. בנוסף, תאי T Csf2– / – נכשלה לזירוז ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) לאחר להיות הועבר adoptively לנמענים WT, ואילו תאי T IFNγ או איל-17A שמר את היכולת לתווך EAE7. יתר על כן, מצור של GM-CSF באמצעות נוגדנים נטרול יושבחו חומרת המחלה EAE8. יתר על כן, מחסור של STAT5 בתאי T בעכברים הביא דור THGM מופחתת ו, לכן, ב התנגדות של העכברים EAE פיתוח6. ממצאים אלו מדגישים את החשיבות של תאי T GM-CSF-הבעת ‘H neuroinflammatory חיסון למחלה. לפיכך, קביעת שיטה להבדיל בין תאי T GM-CSF-הבעת ‘H מתאי CD4 + T נאיביים יהיה חשוב בחקר בפתוגנזה של neuroinflammation אוטואימונית ותגובות החיסון T תאית. עם זאת, פרוטוקול זה ביעילות מייצר תאי THGM מ מאתר תמים ש-cd4 + לא הוכח.
כאן אנו מציגים שיטה מבדיל בין תאי THGM מאתר מתאי CD4 + T נאיביים. פרוטוקול זה מתאר את כל התהליך, כולל החילוץ של הטחול מהעכבר, ההכנה של השעיה מתא בודד, הבחירה חיובי CD4, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לתא TH בידול וניתוח. התאים helper T הבדיל מנותחים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמה תא יחיד, מאת-אמת ה-PCR כמותי כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמת mRNA, ו מאת אליסה כדי להעריך את הביטוי ציטוקין ברמת חלבון. בשיטה זו ניתן להחיל מחקרים של ביולוגיה של התא THGM בתנאים שונים, כגון EAE, איפה GM-CSF ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנחנו תיאר פרוטוקול בידול THGM במבחנה מתאי תמים CD4 + עכבר, ואחריו ניתוח של התאים הבדיל כדי לאמת את השיטה. ראוי לציין, הן הטחול ובלוטות הלימפה יכול לשמש עבור תמים CD4 + תא T טיהור ובידול THGM. הביטוי ציטוקין נקבעים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים בשילוב עם cytometry זרימה הראה כי כ-55% של ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים באוניברסיטה הלאומית לבריאות מערכת של סינגפור (T1-2014 Oct-12 ו T1-2015 Sep-10).
Materials
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
- Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
- Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905 (2014).
- Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets…Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149 (2017).
- Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
- Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
- Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
- El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
- Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
- Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).
