In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM)
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per differenziare murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing linfociti T helper (THGM) da cellule T CD4 + ingenuo, incluso l’isolamento delle cellule T CD4 + Naive, differenziazione di THGM, e analisi delle cellule di THGM differenziate. Questo metodo può essere applicato agli studi del regolamento e la funzione delle cellule di THGM.
Abstract
Il fattore di stimolazione del granulocyte-macrofago-colonia (GM-CSF)-la produzione di cellule T helper (THGM) è un sottoinsieme di cellule helper T recentemente identificato che principalmente secerne GM-CSF senza produrre l’interferone (IFN) γ o interleuchina (IL) -17 e si trova a svolgono un ruolo essenziale nella neuroinfiammazione autoimmuni. Un metodo di isolamento di cellule T CD4 + ingenuo da una cella singola sospensione degli splenocytes e generazione di cellule THGM da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe una tecnica utile nello studio dell’immunità mediata da cellule T e malattie autoimmuni. Qui descriviamo un metodo che differenzia le cellule di T di CD4 + ingenuo di topo in cellule di THGM promosse da IL-7. L’esito della differenziazione è stata valutata tramite l’analisi dell’espressione di citochine utilizzando diverse tecniche, tra cui intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso, una reazione a catena quantitativa in tempo reale della polimerasi (PCR), e analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA). Utilizzando il protocollo di differenziazione THGM come descritto qui, circa il 55% delle cellule espresso GM-CSF con una minima espressione di IL2 o IL-17. L’espressione predominante di GM-CSF dalle cellule di THGM è stato ulteriormente confermato dall’analisi dell’espressione di GM-CSF, IL2 e IL-17 a livelli di mRNA e di proteina. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per differenziare le cellule CD4 + T naive a THGM cellule in vitro, che saranno utili nello studio della biologia delle cellule di THGM.
Introduction
Linfociti CD4 + T helper (TH) sono componenti essenziali del sistema immunitario, avendo un ruolo cruciale nella difesa ospite contro gli agenti patogeni microbici, nella sorveglianza del cancro e nell’autoimmunità1,2,3. Al momento dell’attivazione del ricevitore (TCR) di cellule T, cellule T CD4 + ingenuo possono essere differenziate in TH1, TH2, TH 17, o regolamentazione T (Treg) cellule sotto l’influenza di citochine differenti ambienti2,4, 5. recentemente, un nuovo subset di cellule TH , che produce principalmente GM-CSF, è stato identificato e denominato THGM6. La differenziazione delle cellule di THGM è guidata da IL-7 attraverso l’attivazione di un trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione 5 (STAT5). Queste cellule esprimono una grande quantità di GM-CSF pur avendo una bassa espressione di altri TH-cell firma citochine quali IFNγ e IL-176. GM-CSF è stato trovato per svolgere un ruolo critico nello sviluppo di CD4 + T cellulo-mediata neuroinflammation7,8. Rispetto al IFNγ o IL-17-esprimendo le cellule T autoreattive, GM-CSF-esprimendo T cellule trasferito al selvaggio-tipo topi (WT) ha causati un inizio più iniziale di malattia e la maggiore severità di malattia. Inoltre, le cellule di T di QCS2– / – non riuscito ad indurre encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) dopo essere stato trasferito passivamente ai destinatari WT, mentre le cellule di T che mancano IFNγ o IL-17A mantenuto la capacità di mediare EAE7. Inoltre, un blocco di GM-CSF utilizzando anticorpi neutralizzanti ha migliorato EAE malattia gravità8. Inoltre, una carenza di STAT5 in cellule di T in topi ha provocato in una generazione di THGM diminuita e, quindi, in una resistenza dei topi a EAE sviluppo6. Questi risultati sottolineano l’importanza delle cellule di T di GM-CSF-esprimendoH nella malattia autoimmune neuroinfiammatorie. Quindi, stabilire un metodo per differenziare le cellule di T di GM-CSF-esprimendoH da cellule T CD4 + ingenuo sarebbe importante nello studio della patogenesi autoimmune neuroinflammation e immunitaria mediata da cellule T. Tuttavia, un protocollo che efficientemente genera cellule THGM da murino ingenuo che CD4 + non è stata stabilita.
Qui presentiamo un metodo che differenzia cellule murine THGM da cellule T CD4 + ingenuo. Questo protocollo descrive l’intera procedura, compreso l’estrazione della milza dal mouse, la preparazione di una sospensione unicellulare, la selezione positiva CD4, la cella di fluorescenza-attivato ordinano (FACS) e la cellula di TH differenziazione e analisi. Il differenziato cellule T helper vengono analizzate da intracellulare cytokine colorazione combinato con citometria a flusso per determinare l’espressione di citochine a livello di singola cellula, mediante una PCR quantitativa in tempo reale per determinare l’espressione di citochine a livello di mRNA, e da ELISA per valutare l’espressione di citochine a livello di proteina. Questo metodo può essere applicato agli studi di biologia cellulare THGM in varie condizioni, come ad esempio EAE, dove GM-CSF svolge un ruolo importante nella patogenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto un protocollo di una differenziazione in vitro THGM da ingenuo CD4 + cellule di topo, seguita da un’analisi delle cellule differenziate per convalidare il metodo. Della nota, linfonodi e milza può essere utilizzati per ingenuo purificazione di cellule T CD4 + e THGM differenziazione. L’espressione di citochine determinato macchiando intracellulari di cytokine combinato con citometria a flusso ha mostrato che circa il 55% delle cellule sono state indotte a diventare GM…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da borse di studio dal National University salute sistema di Singapore (T1-2014 ott-12 e T1-2015 set-10).
Materials
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
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