इन विट्रो में माउस का भेदभाव Granulocyte-मैक्रोफेज-कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ)-उत्पादन टी हेल्पर (टीएचजीएम) कोशिकाओं
Summary
यहां, हम murine granulocyte अंतर करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक-कारक उत्पादन टी हेल्पर (टीएचजीएम) भोली CD4 + टी कोशिकाओं से, भोली CD4 के अलगाव सहित + टी कोशिकाओं, टीएचजीएम के भेदभाव, और विभेदित टीएचजीएम कोशिकाओं का विश्लेषण । इस विधि के विनियमन और टीएचजीएम कोशिकाओं के समारोह के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है ।
Abstract
granulocyte-मैक्रोफेज-कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ)-उत्पादन टी हेल्पर (टीएचजीएम) सेल एक नई पहचान टी सहायक सेल सबसेट है कि मुख्य रूप से इंटरफेरॉन (IFN) γ या interleukin (IL) के उत्पादन के बिना जीएम-सीएसएफ स्रावित-17 और पाया जाता है स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammation में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं । splenocytes और टीएचजीएम सेल पीढ़ी के भोली CD4 + टी कोशिकाओं से एक एकल सेल निलंबन से भोली CD4 + टी कोशिकाओं के अलगाव की एक विधि टी कोशिका मध्यस्थता प्रतिरक्षा और स्व-प्रतिरक्षित रोगों के अध्ययन में एक उपयोगी तकनीक होगी । यहां हम एक विधि का वर्णन है कि माउस भोली CD4 + टीएचजीएम कोशिकाओं आईएल-7 द्वारा पदोंनत में अंतर । भेदभाव के परिणाम साइटोकिंस अभिव्यक्ति के विश्लेषण के द्वारा मूल्यांकन किया गया था, intracellular cytokine प्रवाह cytometry, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के साथ संयुक्त धुंधला सहित विभिंन तकनीकों का उपयोग, और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) । यहां वर्णित के रूप में टीएचजीएम भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर, कोशिकाओं के बारे में ५५% IFNα या IL-17 की एक ंयूनतम अभिव्यक्ति के साथ जीएम सीएसएफ व्यक्त की । टीएचजीएम कोशिकाओं द्वारा जीएम-सीएसएफ की प्रमुख अभिव्यक्ति और mRNA और प्रोटीन के स्तर पर जीएम-सीएसएफ, IFNα, और आईएल-17 की अभिव्यक्ति के विश्लेषण के द्वारा पुष्टि की गई थी । इस प्रकार, इस विधि टी एच जीएम कोशिकाओं को भोली CD4 + टी कोशिकाओं में अंतरकरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता इन विट्रो, जो टीएचजीएम सेल जीवविज्ञान के अध्ययन में उपयोगी हो जाएगा ।
Introduction
CD4 + टी हेल्पर (टीएच) कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रणाली के आवश्यक घटक हैं, माइक्रोबियल रोगजनकों के खिलाफ मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका होने, कैंसर निगरानी में, और प्रतिरक्षा में1,2,3। टी सेल रिसेप्टर (TCR) सक्रियण पर, भोली CD4 + टी कोशिकाओं अलग cytokine milieus2,4के प्रभाव में टी एच 1, टीएच2, टीएच 17, या विनियामक टी (Treg) कोशिकाओं में अंतर किया जा सकता है, 5. हाल ही में, टीएच कोशिकाओं का एक नया सबसेट, जो मुख्य रूप से जीएम-सीएसएफ पैदा करता है, की पहचान की और टीएचजीएम6नाम दिया गया था । टीएचजीएम कोशिकाओं के भेदभाव IL-7 द्वारा एक संकेत transducer और प्रतिलेखन 5 (STAT5) के एक उत्प्रेरक के सक्रियकरण के माध्यम से संचालित है । इन कोशिकाओं को एक बड़ी मात्रा में जीएम-सीएसएफ का इजहार करते हुए अन्य टीएचसेल सिग्नेचर साइटोकिंस जैसे IFNγ और आईएल-176की कम अभिव्यक्ति रही. जीएम-सीएसएफ को CD4 + टी सेल-मध्यस्थता neuroinflammation7,8के विकास में अहम भूमिका निभाने के लिए मिला था । IFNγ-या IL-17-व्यक्त की तुलना में प्रतिक्रियात्मक टी कोशिकाओं, जीएम-सीएसएफ-एक्सप्रेस टी कोशिकाओं जंगली प्रकार (WT) को हस्तांतरित चूहों एक पूर्व रोग शुरुआत और उच्च रोग गंभीरता का कारण बना । इसके अलावा, Csf2-/टी कोशिकाओं को प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) WT प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित adoptively होने के बाद प्रेरित करने में विफल रहा है, जबकि टी कोशिकाओं IFNγ या IL-17A की कमी EAE7मध्यस्थता करने की क्षमता बनाए रखा । इसके अलावा, जीएम-सीएसएफ बेअसर एंटीबॉडी उन्नत EAE रोग गंभीरता8का उपयोग कर के एक नाकाबंदी । इसके अलावा, चूहों में टी कोशिकाओं में STAT5 की कमी एक कम टीएचजीएम पीढ़ी के परिणामस्वरूप और, इसलिए, चूहों के एक प्रतिरोध में EAE विकास6. ये निष्कर्ष जीएम-सीएसएफ-व्यक्त टीएच कोशिकाओं के महत्व को स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammatory रोग में रेखांकित करते हैं । इस प्रकार, जीएम-सीएसएफ-व्यक्त टीएच कोशिकाओं में अंतर करने के लिए एक विधि की स्थापना भोली CD4 + टी कोशिकाओं से स्व-प्रतिरक्षित neuroinflammation और टी कोशिका की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के रोगजनन के अध्ययन में महत्वपूर्ण होगा. हालांकि, एक प्रोटोकॉल है कि कुशलतापूर्वक murine भोली CD4 से टीएचजीएम कोशिकाओं उत्पंन + स्थापित नहीं किया गया है ।
यहां हम एक विधि है कि murine टीएचजीएम कोशिकाओं भोली CD4 + टी कोशिकाओं से अलग प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन पूरी कार्यविधि, माउस से तिल्ली की निकासी सहित, एक एकल-सेल निलंबन की तैयारी, CD4 सकारात्मक चयन, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS), और टीएच सेल विभेद और विश्लेषण । विभेदित टी सहायक कोशिकाओं intracellular cytokine प्रवाह cytometry के साथ संयुक्त एक-कोशिका स्तर पर cytokine अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए, एक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा cytokine स्तर पर mRNA अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए, और विश्लेषण कर रहे है एलिसा द्वारा प्रोटीन के स्तर पर cytokine अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए । इस विधि EAE, जहां जीएम सीएसएफ रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है जैसे विभिन्न स्थितियों के तहत टीएचजीएम सेल जीवविज्ञान के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्णित इन विट्रो टीएचजीएम भेदभाव से माउस भोली CD4 + कोशिकाओं, विभेदित कोशिकाओं के विश्लेषण के बाद विधि को मांय करने के लिए । नोट की, दोनों तिल्ली और लिम्फ नोड्स भोली CD4 + टी सेल शु…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय स्वास्थ्य प्रणाली (t1-2014 Oct-12 और t1-2015 Sep-10) से अनुदान का समर्थन किया गया था ।
Materials
| RPMI 1640 | Biowest | L0500-500 | |
| FBS Heat Inactivated | Capricorn | FBS-HI-12A | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| 10x PBS | 1st Base | BUF-2040-10 | Diluted to 1x PBS in sterile water |
| EDTA | 1st Base | BUF-1053-100ml-pH8.0 | |
| 10X ACK buffer | Biolegend | 420301 | diluted in sterile water |
| cell strainer | SPL Life Sciences | 93070 | |
| CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-201 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| 1ml syringe | Terumo | SS+01T | |
| Centrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5810R | |
| Sony SY3200 cell sorter | Sony | Sony SY3200 cell sorter | |
| 50ml conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 210261 | |
| 15m conical centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| FACS tube | Corning | 352054 | |
| 24 well cell culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| anti-mouse CD4 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0041-82 | |
| PE conjugated anti-mouse CD25 (IL-2Ra, p55) | eBioscience | 12-0251-82 | |
| anti-human/mouse CD44 APC | eBioscience | 17-0441-82 | |
| anti-mouse CD62L FITC | eBioscience | 11-0621-85 | |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | 640010 | |
| Hyclone Trypan Blue Solution | GE healthcare Life Sciences | SV30084.01 | |
| microscope | Nikon | Nikon Elipse TS100 | |
| Purified anti-mouse CD3e antibody | Biolegend | 100314 | |
| Purified hamster anti-mouse CD28 | BD Biosciences | 553295 | |
| Purified Rat anti-mouse IFNγ | eBioscience | 16-7312-85 | |
| Purified anti-mouse IL-4 Antibody | Biolegend | 504102 | |
| Recombinant Mouse IL-7 Protein | R&D system | 407-ML | |
| Recombinant Mouse IL-6 | R&D system | 406‑ML | |
| recombinant human TGF-beta | R&D system | 240-B-010 | |
| PMA | Merck Millipore | 19-144 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| GolgiPlug protein transport inhibitor | BD Biosciences | 51-2301KZ | |
| Intracellular Fixation&Permeabilization buffer set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| anti-mouse GM-CSF PE | eBioscience | 12-7331-82 | |
| FITC anti-mouse IL-17A | Biolegend | 506908 | |
| APC anti-mouse IFN-gamma | Biolegend | 505810 | |
| GO Taq qPCR master mix | Promega | A6002 | |
| mouse GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! | invitrogen | 88-7334-88 | |
| Mouse IL-17A Uncouted ELISA | invitrogen | 88-7371-22 |
References
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