Caracterización funcional de carboxilesterasas en casa resistente al insecticida moscas, Musca Domestica
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para producir casa mosca carboxilesterasa proteínas en vitro con un sistema de expresión de baculovirus mediada por células de insectos y caracterizar funcionalmente más adelante su papel en la metabolización de permetrina, de tal modo, que confieren piretroides resistencia mediante la realización de celular MTT análisis y en vitro estudios metabólicos.
Abstract
Metabolismo mediado por la carboxilesterasa se piensa para desempeñar un papel importante en la resistencia a los insecticidas en los insectos varios. Varios genes de la carboxilesterasa fueron encontrados para arriba-regulados en la cepa mosca de casa resistente, mientras que seguía habiendo sus papeles en que confieren resistencia a los insecticidas para ser explorado. Aquí, hemos diseñado un protocolo para la caracterización funcional de carboxilesterasas. Se presentan tres experiencias de ejemplo: (1) expresión y aislamiento de proteínas de la carboxilesterasa a través de un insecto mediada por baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) sistema de expresión celular; (2) torneo de mesas múltiples basadas en células (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromuro) ensayo de citotoxicidad para medir la tolerancia de las células de insecto permethrin diferentes tratamientos; y (3) en vitro estudios metabólicos para explorar las capacidades metabólicas de carboxilesterasas hacia permetrina. El gen de la carboxilesterasa MdαE7 fue clonado de una casa resistente a mosca cepa ALHF y utilizados para construir un baculovirus recombinante para la infección de las células Sf9. Las viabilidades de célula contra permethrin diferentes tratamientos fueron medidos en el ensayo MTT. La tolerancia de la célula mejorada del grupo experimental (células de MdαE7 recombinante baculovirus infectadas) comparado con los de los grupos de control (CAT-recombinante baculovirus infectadas células y GFP-recombinante baculovirus infectadas células) a la permetrina tratamientos sugieren las capacidades de MdαE7 en metabolizan insecticidas, protegiendo las células contra los daños químicos. Además, carboxilesterasa proteínas fueron expresadas en células Sf9 insectos y aisladas para llevar a cabo un estudio metabólico en vitro . Nuestros resultados indican una significativo en la vitro eficiencia metabólica de MdαE7 hacia la permetrina, indicando directamente la participación de carboxilesterasas en metabolizan insecticidas y así que confieren resistencia a los insecticidas en casa vuela.
Introduction
Resistencia a los insecticidas es actualmente un grave problema de casa control de moscas en todo el mundo1,2. Esfuerzos para determinar el mecanismo de resistencia a los insecticidas facilita la mejor comprensión de este tema y así proporcionar nuevas estrategias para efectivamente prevenir o minimizar la propagación de resistencia desarrollo3. Carboxilesterasas, como una de las enzimas de desintoxicación más importantes, han atraído mucho la atención por su participación en el secuestro y metabolizan insecticidas en varios insectos4,5,6. Nuestro estudio anterior ha identificado múltiples carboxilesterasas en casa vuelan y sus niveles de expresión no sólo fueron constitutivamente para arriba-regulados en la cepa ALHF resistente pero también pueden ser inducido a mayores niveles en respuesta a los tratamientos de permetrina7 . Sin embargo, la caracterización funcional de estos genes carboxilesterasa en metabolizan insecticidas aún explorarse.
Desde el primer informe de principios de la década de 19808, un sistema de expresión de baculovirus-mediada gen extranjero ha sido empleado ampliamente debido a su eficiencia de producción de alto valor proteico y proteína eucariota procesamiento capacidades9. Este sistema binario se compone de dos elementos esenciales: el baculovirus recombinante construcción entrega de genes foráneos en las células del huésped y la expresión a gran escala de proteínas interesadas por las células infectadas por el baculovirus recombinante. En las últimas décadas, el sistema de expresión de baculovirus mediada por células ha sido ampliamente utilizado para producir miles de proteínas recombinantes, que van desde enzimas citosólicas a las proteínas de membrana-limitan en insectos y mamíferos las células10. Nuestro estudio anterior ha expresado con éxito múltiples enzimas CYP450 en insectos células Sf9 con este sistema11. En este estudio, construido un baculovirus recombinante carboxilesterasa para infectar insectos células Sf9, exploró la tolerancia celular a permetrina diferentes tratamientos y a gran escala carboxilesterasa expresa proteínas en vitro para funcional exploración. En lugar de investigar múltiples mezclas de isoenzima carboxilesterasa de insectos homogenados adoptados por anteriores estudios12,13, este sistema de expresión celular de insecto baculovirus-mediada permite la expresión concreta y aislamiento de proteínas específicas para la mejor caracterización de sus propiedades bioquímicas y estructurales.
El ensayo basado en la sal de tetrazolio (MTT) es un método colorimétrico de alto rendimiento desarrollado y optimizado para medir la viabilidad de las células. Este ensayo se basa en el mecanismo que sólo las células vivas son capaces de metabolizar el reactivo MTT de color amarillo a un precipitado precipitado de color púrpura oscuro, que puede ser analizado por después de disuelto en solventes orgánicos14, 15. Varios más preciso pero requiere mucho tiempo métodos, como la exclusión azul de tripano y la timidina titulación ensayo16,17, se han desarrollado en los últimos años. Sin embargo, el ensayo MTT celular aún en la actualidad es reconocido como el método más rápido y fácil manejo para detectar rápidamente la viabilidad celular. Aquí, utilizamos el ensayo MTT para explorar la tolerancia de la célula contra los tratamientos insecticidas. La mayor tolerancia de las células cuando infectadas con baculovirus recombinante carboxilesterasa fuertemente apoya las funciones metabólicas de carboxilesterasas a los insecticidas, que a su vez, sugiere su participación en la resistencia a los insecticidas.
Además, un ensayo en vitro metabólica también se realizó en este estudio. En comparación con ensayos de carboxilesterasa general que utilizan sustratos comunes tales como acetato de α-napthyl (α-NA) y β-naftil acetato (β-NA) para reflejar actividades hidrolíticas de carboxilesterasas, estudio metabólico en vitro es considerado como una forma precisa medir directamente actividades de carboxilesterasas hacia insecticidas18. Este método se ha empleado con éxito en varios insectos para caracterizar varios cytochrome P450s en asociación con insecticida resistencia11,19,20. Sin embargo, este método ha no aún ha aplicado en estudios de la carboxilesterasa. Con la disponibilidad de la carboxilesterasa proteínas producidas por el sistema de expresión de baculovirus-mediada, podemos realizar un estudio metabólico en vitro de carboxilesterasas hacia permetrina, que puede proporcionar más fuerte evidencia de la participación de carboxilesterasas en confiriendo resistencia a piretroides en casa vuela.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las últimas décadas, sistemas de expresión heteróloga se han utilizado ampliamente para expresar y para aislar grandes cantidades de proteínas, permitiendo la determinación bioquímica y funcional y caracterización de enzimas en vitro. Hasta la fecha, varios sistemas de modelo diferente, incluyendo Escherichia coli, Sacccharomyces cerevisiae, Pichia pastorisy Spodoptera frugiperda han sido adaptados para la expresión de la proteína recombinante y la elección de la…
Materials
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
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