Nous présentons ici un protocole pour produire chambre carboxylestérase mouche protéines in vitro avec un système d’expression baculovirus médiée par cellule insectes et plus tard fonctionnellement caractériser leurs rôles en métabolisant perméthrine, ainsi, conférant aux pyréthrinoïdes résistance en procédant à base de cellules MTT dosage et in vitro études métaboliques.
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Article de méthode
Caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases chez les mouches maison résistant aux insecticides, Musca Domestica
Dans cet article
Résumé
Résumé
Métabolisme médié par la carboxylestérase est censé jouer un rôle majeur dans la résistance aux insecticides chez les insectes divers. Plusieurs gènes de la carboxylestérase trouvées régulée dans la souche mouche résistant à la maison, tandis que leurs rôles en conférant la résistance aux insecticides restaient à explorer. Ici, nous avons conçu un protocole de caractérisation fonctionnelle des carboxylestérases. Trois expériences d’exemple sont présentés : (1) expression et l’isolement des protéines carboxylestérase grâce à un insecte médiée par les baculovirus Spodoptera frugiperda (Sf9) système d’expression cellulaire ; (2) un MTT à base de cellules (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromure) test de cytotoxicité pour mesurer la tolérance des cellules d’insectes à la perméthrine différents traitements ; et (3) in vitro études métaboliques d’explorer les capacités métaboliques des carboxylestérases vers la perméthrine. Le gène de la carboxylestérase MdαE7 a été cloné à partir d’une maison résistante voler souche ALHF et utilisé pour construire un baculovirus recombinant pour l’infection de cellules Sf9. La viabilité cellulaire contre perméthrine différents traitements ont été mesurée avec le test MTT. La tolérance des lymphocytes améliorés du groupe expérimental (cellules de baculovirus infectés MdαE7 recombinant) comparé à ceux des groupes témoins (cellules infectées de baculovirus recombinant CAT et cellules infectées de baculovirus recombinant GFP) de perméthrine traitements a suggéré les fonctionnalités de MdαE7 dans le métabolisme des insecticides, protégeant ainsi les cellules des dommages chimiques. En outre, carboxylestérase protéines étaient exprimées dans des cellules d’insecte Sf9 et isolés pour mener une étude métabolique in vitro . Nos résultats ont indiqué une significative in vitro l’efficacité métabolique de MdαE7 vers la perméthrine, directement indiquant l’implication des carboxylestérases en métabolisant les insecticides et conférant ainsi la résistance aux insecticides dans la maison d’oiseau.
Introduction
Résistance aux insecticides est actuellement un enjeu majeur du contrôle de la mouche de maison dans le monde1,2. Efforts pour déterminer que le mécanisme de résistance aux insecticides permet de mieux comprendre cette question et de fournir ainsi des stratégies novatrices pour efficacement prévenir ou limiter la propagation de la résistance développement3. Carboxylestérases, comme l’une des enzymes de détoxication importants, ont attiré beaucoup d’attention pour leur rôle dans la séquestration et métabolisant les insecticides chez divers insectes4,
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Protocole
1. l’expression et l’isolement des protéines cibles avec un système d’Expression Baculovirus insectes cellulaire
- Directionnellement clone amplicons émoussé-terminée de protéines cibles de mouches domestiques.
- Design des amorces PCR de la protéine fluorescente verte (GFP) et le gène de MdαE7 mouche de maison basée sur les séquences et les exigences particulières du vecteur choisi (tableau 1).
- Utilisez une ADN polymérase thermostable, relecture et amorces de l’étape 1.1.1 pour effectuer une réaction de PCR de 150 µL (30 µL de tampon de réaction, 3 µL des dNTPs 10 mM, 1,5 µL de l’ADN polymérase, 6 µL de maison modèle mouche A....
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Résultats
La viabilité des cellules vers la perméthrine différents traitements (test MTT)
La cytotoxicité de la perméthrine a été examinée dans MdαE7-recombinant baculovirus infectés Sf9 cellules (groupe expérimental) et CAT-recombinant baculovirus (fourni par le kit de baculovirus infecté) infectés (groupe témoin). Les tolérances de cellule renforcée à la perméthrine dans MdαE7 exprimant des cellules fortement appuient les rôles métabolique.......
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Discussion
Ces dernières décennies, des systèmes d’expression hétérologue ont été employé couramment pour exprimer et isoler les grandes quantités de protéines, ce qui permet la détermination biochimique et fonctionnelle et la caractérisation des enzymes in vitro. A ce jour, plusieurs systèmes de modèles différents dont Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiaeet Spodoptera frugiperda ont été adaptés pour l’expression de protéine recombinante et le choix de la système .......
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ADN polymérase haute fidélité Q5 | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Kit de clonage, avec One Shot TOP10 Chimiquement compétent E. coli | Invitrogen par life technology | K240020 | S.O.C medium et des amorces universelles de séquence M13 ont été incluses dans ce kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Mélange d’enzymes pour BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| Kit de transfection d’ADN linéaire BaculoDirect C-Term | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Le réactif de transfection Cellfectin et le ganciclovir étaient inclus dans ce kit |
| Plasmide pENTR-CAT | Invitrogen par life technology | Inclus dans le kit de transfection d’ADN linéaire BaculoDirect C-Term, concentration : 0,5 ug/uL | |
| Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, certifié | Gibco par Life Technologies | 10082-139 | |
| Cellules Sf9 dans le Sf-900 III SFM | Gibco par Life | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Tampon de lyse | G Biosciences par A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| SF-900 III SFM (1× ;) Milieu sans sérum Complet | Gibco de Life Technologies | 12658-019 | |
| Milieu pour insectes de Grace, non supplémenté | Gibco de Life Technologies | 11595030 | |
| Perméthrine (isomères) étalon analytique | SUPELCO de Solutions WithinTM | 442748 | |
| Méthanol (classé analytique) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acétonitrile (grade analytique) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Filtres pour seringue avec 0,45 &mu ; m Membrane GHP (certifiée HPLC) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 Système HPLC | Waters | ||
| T100 Thermal | Cycle Bio-Rad Laboratories Inc. | ||
| Spectrophotomètres Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Lecteur multimode | BioTek |
Références
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al.
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Réimpressions et autorisations
