살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

Summary

여기, 우리 제시 집 플라이 carboxylesterase 단백질에서 생체 외에서 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템으로 생산 하 고 나중 기능 metabolizing permethrin에 그들의 역할을, 특성화를 프로토콜 pyrethroid 부여 셀 기반 MTT 분석 결과 및 체 외에서 대사 연구를 실시 하 여 저항.

Abstract

Carboxylesterase 중재 대사는 다양 한 곤충의 살충제 저항에 중요 한 역할을 생각입니다. 몇몇 carboxylesterase 유전자 살충제 저항을 부여에 있는 그들의 역할 탐구 될 남아 반면 내성 집 비행 긴장에서 최대 통제 발견 됐다. 여기, 우리는 carboxylesterases의 기능 특성에 대 한 프로토콜 설계 되었습니다. 3 예제 실험 제공 됩니다: (1) 식과 잠재 중재 곤충 Spodoptera frugiperda (Sf9) 셀 식 시스템을 통해 carboxylesterase 단백질의 격리 (2) 셀 기반 MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드) 세포 독성 분석 결과 다른 permethrin 치료; 곤충 세포의 허용 오차를 측정 하 (3) 생체 외에서 대사 연구를 permethrin로 carboxylesterases의 대사 기능을 탐구 하 고. MdαE7 저항 하는 집에서 복제는 carboxylesterase 유전자 변형 ALHF 조종 하 고 Sf9 세포 감염에 대 한 재조합 잠재를 구성 하는 데 사용. 셀 viabilities 다른 permethrin 치료에 대 한 MTT 분석 결과와 측정 되었다. Permethrin 제어 그룹 (고양이 재조합 잠재 감염 세포와 GFP 재조합 잠재 감염 세포)의 그들과 비교 된 실험 그룹 (MdαE7-재조합 잠재 감염 세포)의 향상 된 셀 허용 치료는 살충제, 화학 손상에서 세포를 보호 함으로써 metabolizing에서 MdαE7의 기능을 제안 했다. 게다가, carboxylesterase 단백질 곤충 Sf9 세포에 표현 되었고 고립 생체 외에서 대사 연구를 실시. 우리의 결과 중요 한 생체 외에서 대사 효율을 MdαE7의 향해 permethrin, 직접 살충제를 metabolizing에서 carboxylesterases의 개입을 나타내는 표시를 따라서 집에서 살충제 저항을 부여 있습니다.

Introduction

살충제 저항은 현재 하우스 비행 제어 전세계^1,2의 주요 문제 이다. 살충제 저항 메커니즘을 결정 하는 노력이 문제의 더 나은 이해를 용이 하 게 하 고 따라서 새로운 전략을 효과적으로 방지 하거나 저항 개발³의 확산을 최소화를 제공 합니다. Carboxylesterases, 주요 해독 효소 중 하나로 격리 및 다양 한 곤충^4,,56에 살충제를 metabolizing에서 그들의 역할에 대 한 관심을 많이 받고 있다. 우리의 이전 연구는 집 파리에 여러 carboxylesterases를 발견 했다와 그들의 식 레벨만 constitutively 최대 저항 하는 ALHF 긴장에 규제 있었지만 또한 높은 유발된 수준 permethrin 치료^{7에 대 한에서 일 수 있다} . 그러나, 살충제를 metabolizing에서이 carboxylesterase 유전자의 기능 characterizations 탐험 남아 있다.

초기 1980 년대⁸에서 첫 번째 보고서 이후 외국 유전자 잠재 중재 식 시스템은 널리 고용 높은 단백질 생산 효율성 및 기능⁹를 처리 하는 진 핵 단백질. 이 이진 시스템은 두 개의 필수 요소 구성: 생성 된 재조합 잠재 호스트 세포와 세포 재조합 잠재 감염 하 여 관심된 단백질의 대규모 식으로 외국 유전자를 제공. 지난 수 십년 동안 잠재 중재 셀 식 시스템 곤충에 막 도약 단백질을 cytosolic 효소에서 배열 하는 재조합 단백질의 수천을 생산 하기 위해 널리 이용 되는 고 포유동물 세포¹⁰. 우리의 이전 연구는 성공적으로이 시스템¹¹곤충 Sf9 세포에 여러 CYP450 효소를 표현 했다. 이 연구에서 우리 곤충 Sf9 세포를 감염 하는 carboxylesterase 재조합 잠재 건설, 셀 공차를 다른 permethrin 처리 및 대규모 표현된 carboxylesterase 단백질에서 체 외에 대 한 탐구 기능 탐구입니다. 이전 연구^12,13로 채택 곤충 homogenates에서 여러 carboxylesterase isozyme 혼합물을 조사, 대신이 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 특정 식 수 및 그들의 생 화 학적 및 구조적 특성의 더 나은 특성에 대 한 타겟된 단백질의 격리.

Tetrazolium 소금 기반 시험 (MTT)은 높은 처리량 색도계 방법 개발 및 세포 생존 능력을 측정 하도록 최적화입니다. 이 분석 결과 살아있는 세포만 분석 될 수 있다 colorimetrically 유기 용 매^{14에에서 용 해 한 후, 어두운 자주색 색깔된 formazan 침전에 노란색 색 MTT 시 약을 물질 대사로 변화 시키기의 수 있는 메커니즘에 따라 15}. Trypan 블루 제외 등 티 미 딘 적정 분석 결과^16,17시간이 걸리는 방법, 그러나 더 정확 하 게 몇몇 최근 몇 년 동안에서 개발 되었습니다. 그러나, 셀 기반 MTT 분석 결과 여전히 현재 인식 가장 신속 하 고 쉽게 운영 방법으로 신속 하 게 세포 생존 능력을 감지 하. 여기, MTT 분석 결과 사용 하 여 살충제 처리에 대 한 셀 공차를 탐험. 셀 때 강하게 carboxylesterase 재조합 잠재 감염의 향상 된 공차에 살충제 저항에 그들의 관련을 건의 하는 살충제에 carboxylesterases의 대사 역할을 지원 합니다.

또한, 생체 외에서 대사 분석 결과 또한이 연구에서 실시 되었다. 생체 외에서 대사 연구는 정확한 방법으로 여겨진다 carboxylesterases의 가수분해 활동을 반영 하기 위해 일반적인 기판 α-napthyl 아세테이트 (α-나) 등 β naphthyl 아세테이트 (β-없음)를 사용 하는 일반적인 carboxylesterase 분석 실험에 비해, 직접 carboxylesterases 살충제¹⁸대의 활동을 측정 합니다. 이 방법은 성공적으로 다양 한 곤충에 살충제 저항^11,,1920와 협회에서 여러 시 토 크롬 P450s 하를 고용 하고있다. 그러나,이 방법은 하지 아직 적용 되었습니다 carboxylesterase 연구에서. 잠재 중재 식 시스템에 의해 생산 하는 carboxylesterase 단백질의 가용성, 우리는 체 외에서 대사 연구 permethrin, 더는 참여의 강력한 증거를 제공할 수 있는 방향으로 carboxylesterases의 실행할 수 있다 집에서 pyrethroid 저항을 부여에 carboxylesterases의 파리.

Protocol

1. 식 및 곤충 세포 잠재 중재 식 시스템 대상 단백질의 격리 으로 집에서 파리에서 대상 단백질의 무뚝뚝한 끝난 PCR 제품을 복제. 녹색 형광 단백질 (GFP)의 PCR 뇌관과 집 플라이 MdαE7 유전자 그들의 순서 및 선택한 벡터 (표 1)의 특별 한 요구에 따라 디자인. 내, 교정 DNA 중 합 효소 및 단계 1.1.1에서에서 프라이 머를 사용 하 여 수행 (30 µ L의 반응 버퍼, 10mm dNTPs, DNA …

Representative Results

다른 permethrin 치료 (MTT assay)으로 세포 생존 능력 Permethrin의 세포 독성 MdαE7 재조합 잠재 감염 Sf9 셀 (실험 그룹)과 고양이 재조합 잠재 감염 (잠재 감염 키트에 의해 제공) 셀 (제어 그룹)에서 시험 되었다. 향상 된 셀 공차 세포를 강하게 표현 하는 MdαE7에 permethrin 살충제와 화학 손상에서 따라서 보호 셀이이 carboxylesterase의 대사 역…

Discussion

최근 수십 년간, 분리 식 시스템 널리 표현 하 고 많은 양의 단백질, 생화학 및 기능 확인 및 체 외에서효소의 특성화 되므로 격리 사용 되었습니다. 날짜 하려면, 대장균, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae및 Spodoptera frugiperda 를 포함 하 여 여러 다른 모델 시스템은 재조합 형 단백질 표정, 그리고의 선택에 대 한 적응 되었습니다는 생체 외에서 시스템 관심된 …

Materials

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs inc.	M0491L
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen by life technology	K240020	S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen by life technology	K210002
Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits	Invitrogen by life technology	11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit	Invitrogen by life technology	12562-019	Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit
pENTR-CAT plasmid	Invitrogen by life technology		Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL
Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified	Gibco by Life Technologies	10082-139
Sf9 cells in Sf-900 III SFM	Gibco by Life Technologies	12659017
Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer	G Biosciences by A Geno Technology Inc	786-411
Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete	Gibco by Life Technologies	12658-019
Grace's Insect Medium, unsupplemented	Gibco by Life Technologies	11595030
Permethrin (isomers) analytical standard	SUPELCO by Solutions WithinTM	442748
Methanol (analytical graded)	Sigma-Aldrich	67-56-1
Acetonitrile (analytical graded)	Sigma-Aldrich	75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified)	Pall Life Sciences	21890388
Alliance Waters 2695 HPLC System	Waters
T100 Thermal Cycle	Bio-Rad Laboratories Inc.	1861096
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader	BioTek