Funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases in Insektizid gegen Stubenfliegen, Musca Domestica
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Produktion Haus fliegen Carboxylesterase Proteine in Vitro mit einem Baculovirus vermittelte Insekt Ausdruck Zellsystem und später funktionell charakterisieren ihre Rolle bei der Metabolisierung Permethrin, dadurch konferieren pyrethroid Widerstand von zellbasierten MTT-Assay und in-vitro- metabolische Studien.
Abstract
Carboxylesterase vermittelte Stoffwechsel wird gedacht, um in Insektizid Widerstand bei verschiedenen Insekten eine wichtige Rolle spielen. Mehrere Carboxylesterase Gene wurden bis in die resistenten Haus fliegen Belastung geregelt gefunden, während ihre Rolle bei der Übertragung der Insektizid Widerstand blieb um erkundet zu werden. Hier haben wir ein Protokoll für die funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases entwickelt. Drei Beispiel-Experimenten werden dargestellt: (1) Ausdruck und Isolation von Carboxylesterase Proteinen durch ein Insekt Baculovirus-vermittelten Zellsystem Ausdruck Spodoptera Frugiperda (Sf9); (2) eine zellbasierte MTT (3-[4, 5-Dimethykthiazol-2-Yl] -2, 5-Diphenyltetrazolium-Bromid) Zytotoxizität Assay, Messen Sie die Toleranz von Insektenzellen gegenüber verschiedenen Permethrin Behandlungen; und (3) in-vitro- metabolische Studien, die metabolische Funktionen des Carboxylesterases in Richtung Permethrin zu erkunden. Die Carboxylesterase gen, die MdαE7 aus einem beständigen Haus geklont wurde Belastung ALHF fliegen und verwendet, um eine rekombinante Baculovirus für Sf9 Zellen Infektion zu konstruieren. Die Zelle künstliche gegen verschiedene Permethrin Behandlungen wurden mit dem MTT-Assay gemessen. Die verbesserte Zell Toleranz der Versuchsgruppe (MdαE7-rekombinante Baculovirus infizierte Zellen) im Vergleich zu den Kontrollgruppen (CAT-rekombinante Baculovirus infiziert und GFP-rekombinante Baculovirus infizierte Zellen), permethrin in metabolisierenden Insektizide, dadurch Schutz der Zellen vor chemischen Schäden vorgeschlagenen Behandlungen die Funktionen des MdαE7. Darüber hinaus wurden Carboxylesterase Proteine in Sf9 Insektenzellen ausgedrückt und isoliert, um eine in-vitro- metabolische Studie durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigten eine signifikante in Vitro stoffwechseleffizienz des MdαE7 in Richtung Permethrin, direkt auf die Einbeziehung der Carboxylesterases in metabolisierenden Insektizide und verleiht somit Insektizid Widerstand im Haus fliegt.
Introduction
Insektizid-Widerstand ist derzeit ein wichtiges Thema der Haus Fliegenbekämpfung weltweit1,2. Bemühungen um den Mechanismus der Insektizid Widerstand bestimmen erleichtert dieses Problem besseren zu verstehen und somit für neue Strategien, um effektiv zu verhindern oder zu minimieren die Ausbreitung der Widerstand Entwicklung3. Carboxylesterases, haben eine Menge Aufmerksamkeit für ihre Rollen in Sequestrierung und metabolisierenden Insektizide in verschiedenen Insekten4,5,6als eines der wichtigsten Entgiftung Enzyme angezogen. Unsere früheren Studie identifizierte mehrere Carboxylesterases in Stubenfliegen und ihren Ausdruck Ebenen wurden nicht nur in der resistenten Stamm ALHF konstitutiv geregelt sondern können auch induzierte zu höheren Ebenen in Reaktion auf Permethrin Behandlungen7 . Allerdings müssen die funktionale Charakterisierungen dieser Carboxylesterase Gene in metabolisierenden Insektizide noch erkundet werden.
Seit dem ersten Bericht in den frühen 1980er Jahren8wurde eine Baculovirus-vermittelten Fremdgen Expressionssystems weithin wegen seiner hohen Protein-Produktions-Leistungsfähigkeit und eukaryotic Protein Verarbeitung Funktionen9eingesetzt. Diese binären System besteht aus zwei wesentlichen Elementen: die konstruierte rekombinante Baculovirus Bereitstellung fremder Gene in den Wirtszellen und die groß angelegte Expression interessiert Proteine von Zellen durch rekombinante Baculovirus infiziert. In den letzten Jahrzehnten das Baculovirus vermittelte Zelle Ausdruck System ist weit verbreitet, Tausende von rekombinanten Proteinen, Membrane-springen Proteine im Insekt von zytosolischen Enzyme bis zu produzieren und Säugetier-Zellen10. Unsere früheren Studie äußerte erfolgreich mehrere CYP450 Enzymen in Sf9 Insektenzellen mit diesem System11. In dieser Studie wir konstruiert eine Carboxylesterase-rekombinante Baculovirus Sf9 Insektenzellen infizieren, erkundet die Zelle Toleranz gegenüber unterschiedlichen Permethrin Behandlungen und groß angelegte ausgedrückt Carboxylesterase Proteine in Vitro für funktionale Exploration. Anstatt mehrere Carboxylesterase isozymen Mischungen von Insekten Homogenates wie von früheren Studien12,13angenommen, dieses Insekt Zelle Baculovirus-vermittelten Ausdruck System ermöglicht die Konkretisierung und Isolierung von gezielten Proteine für bessere Charakterisierung ihrer biochemischen und strukturellen Eigenschaften.
Tetrazoliumsalz Salz basierende Assays (MTT) ist ein Hochdurchsatz-kolorimetrischen Verfahren entwickelt und optimiert, um die Zellviabilität messen. Dieser Test basiert auf den Mechanismus, die nur lebende Zellen in der Lage metabolisierenden gelb gefärbten MTT Reagenz zu einem dunklen lila farbigen Formazan Niederschlag, farbmetrisch analysiert werden kann sind, nachdem in organischen Lösungsmitteln14aufgelöst, 15. Einige genauere aber zeitaufwändige Methoden, z. B. Trypan blau Ausgrenzung und das Thymidin Titration Assay16,17, wurden in den letzten Jahren entwickelt. Die zellbasierte MTT-Assay wird jedoch derzeit noch als die schnellste und einfach zu bedienen-Methode anerkannt, Zellviabilität schnell erkennen. Hier verwenden wir die MTT-Assay, um Zell Toleranz gegen insektizidbehandlungen zu erkunden. Die verbesserte Toleranz der Zellen wenn mit rekombinanten Baculovirus Carboxylesterase stark infiziert unterstützt die metabolische Rollen des Carboxylesterases gegen Insektizide, die wiederum ihre Beteiligung in Insektizid Widerstand schlägt.
Darüber hinaus wurde ein in-vitro- metabolische Test auch in dieser Studie durchgeführt. Im Vergleich mit allgemeinen Carboxylesterase Tests, mit denen gemeinsame Substrate wie α-Napthyl-Acetat (α-NA) und β-Naphthyl Acetat (β-NA) hydrolytische Tätigkeit der Carboxylesterases widerspiegeln, ist die in-vitro- metabolische Studie eine genaue Weg angesehen Aktivitäten der Carboxylesterases in Richtung Insektizide18direkt zu messen. Diese Methode wurde bereits erfolgreich in verschiedene Insekten eingesetzt, mehrere Cytochrom P450s in Verbindung mit Insektizid Widerstand11,19,20zu charakterisieren. Allerdings hat diese Methode noch nicht in Carboxylesterase Studien angewendet. Mit der Verfügbarkeit von Carboxylesterase Proteine produziert durch Baculovirus-vermittelten Expressionssystems kann eine in-vitro- metabolische Untersuchung der Carboxylesterases in Richtung Permethrin, führen wir die weitere starke Beweise für die Beteiligung bieten können der Carboxylesterases in Übertragung Pyrethroid-Resistenz im Haus fliegt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten Jahrzehnten haben heterologen Expressionssysteme verbreitet zu äußern und große Mengen von Proteinen, so dass Biochemische und funktionelle Bestimmung und Charakterisierung der Enzyme in Vitrozu isolieren. Bisher wurden mehrere verschiedene Modellsysteme wie Escherichia coli, Pichia Pastoris, Sacccharomyces Cerevisiaeund Spodoptera Frugiperda angepasst für rekombinante Proteinexpression und die Wahl des der in-vitro- System ist entscheidend für gro…
Materials
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs inc. | M0491L | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen by life technology | K240020 | S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit. |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen by life technology | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits | Invitrogen by life technology | 11791-023 | |
| BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit | Invitrogen by life technology | 12562-019 | Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit |
| pENTR-CAT plasmid | Invitrogen by life technology | Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified | Gibco by Life Technologies | 10082-139 | |
| Sf9 cells in Sf-900 III SFM | Gibco by Life Technologies | 12659017 | |
| Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction & Lysis Buffer | G Biosciences by A Geno Technology Inc | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×) Serum Free Medium Complete | Gibco by Life Technologies | 12658-019 | |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Gibco by Life Technologies | 11595030 | |
| Permethrin (isomers) analytical standard | SUPELCO by Solutions WithinTM | 442748 | |
| Methanol (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Acetonitrile (analytical graded) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 μm GHP Membrane (HPLC Certified) | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 HPLC System | Waters | ||
| T100 Thermal Cycle | Bio-Rad Laboratories Inc. | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek |
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