A geração de fraturas fechadas de fêmur em ratos: um modelo para estudar a consolidação óssea

Summary

O modelo murino fratura fechada do fêmur é uma plataforma poderosa para estudar a consolidação da fratura e novas estratégias terapêuticas para acelerar a regeneração óssea. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos, usando uma haste intramedular aço para estabilizar o fêmur.

Abstract

Fraturas ósseas imponham um enorme fardo socio-económica em pacientes, além de afetar significativamente a sua qualidade de vida. Estratégias terapêuticas que promovem a consolidação óssea eficiente são inexistentes e em alta demanda. Eficazes e reprodutíveis de modelos animais de cura de fraturas são necessários para compreender os complexos processos biológicos associados a regeneração óssea. Muitos modelos animais de consolidação da fratura foram gerados ao longo dos anos; no entanto, modelos de fratura murino surgiram recentemente como poderosas ferramentas para estudar a consolidação óssea. Desenvolveram-se uma variedade de modelos abertos e fechados, mas o modelo de fratura fechada do fêmur se destaca como um método simples para a geração de resultados rápidos e podem ser reproduzidos de forma fisiologicamente relevante. O objetivo do presente protocolo cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas unilaterais em camundongos e facilitar uma estabilização pós-fratura do fêmur através da inserção de uma haste intramedular aço. Apesar de dispositivos como um prego ou um parafuso para oferecer maior estabilidade axial e rotacional, o uso de uma haste intramedular fornece uma estabilização suficiente para resultados consistentes de curativas sem produzir novos defeitos no tecido ósseo ou danificar-se nas proximidades de macio tecido. Imagem radiográfica é usada para monitorar a progressão da formação de calo, união óssea e posterior remodelação do calo ósseo. Resultados de cicatrização óssea são normalmente associados com a força do osso curado e medidos com testes de torção. Ainda assim, compreendendo os início eventos celulares e moleculares associados a reparação da fratura é fundamental no estudo da regeneração do tecido ósseo. O modelo de fratura fechada de fêmur em ratos com fixação intramedular serve como uma plataforma atrativa para estudar a consolidação de fratura óssea e avaliar estratégias terapêuticas para acelerar a cicatrização.

Introduction

Fraturas estão entre as lesões mais comuns que ocorrem para o sistema músculo-esquelético e estão associadas com um enorme fardo socioeconômico, incluindo custos de tratamento que são projetados para superar a US $ 25 bilhões anualmente no Estados Unidos^{1, 2}. Embora a maioria das fraturas cura sem incidentes, a cura é associado com substancial tempo de inatividade e perda de produtividade. Aproximadamente 5-10% de todas as fraturas resultar em um atraso de cura ou não-sindicalizados, devido à idade ou outras condições de saúde crônica subjacente, tais como osteoporose e diabetes mellitus^3,4,5. Não há tratamentos farmacológicos aprovados pela FDA estão atualmente disponíveis para promover a cicatrização óssea eficiente e encurtar o tempo de recuperação.

Consolidação da fratura é um processo complexo e altamente dinâmico envolvendo a coordenação de vários tipos de células. Portanto, uma compreensão abrangente dos eventos celulares e moleculares associados a regeneração óssea é crucial para a identificação de alvos terapêuticos que acelerar este processo. Como com outras doenças humanas, o estabelecimento de um modelo animal altamente favorável e reprodutível é crucial no estudo da consolidação óssea. Animais maiores, como ovelhas e suínos, têm propriedades de remodelação óssea e biomecânica semelhantes aos seres humanos, mas são caros, exigem tempo cura substancial e não são facilmente passíveis de manipulação genética⁶. Por outro lado, os modelos animais pequenos, tais como ratos e camundongos, oferecem muitas vantagens, incluindo uma facilidade de manuseio, baixo custo de manutenção, ciclos de reprodução curto e um mais curto de tempo cura⁷. Além disso, o genoma do rato é totalmente sequenciado, permitindo a manipulação rápida e a geração de variantes genéticas. Assim, o mouse é um sistema poderoso modelo para estudar doenças humanas, lesão e reparar a⁸. Em humanos, comorbidades como osteoporose e diabetes mellitus aumentam a probabilidade de uma cicatrização. Um número de modelos existentes do mouse está disponíveis para estudar os efeitos de comorbidades, tais como osteoporose e diabetes mellitus na lesão do osso e cura. Pacientes que sofrem de osteoporose tem uma formação óssea diminuiu acentuadamente durante as fases posteriores de uma fratura cura⁹. Ovariectomizadas ratos (OVX) exibem perda óssea rápida e óssea retardada de cura semelhantes às observadas em osteoporose pós-menopausa^10,11. Além disso, muitos modelos de mouse do tipo I e tipo diabetes II imitar a fenótipos massa óssea baixa e prejudicada consolidação visto em humanos¹¹. Além disso, modelos de fratura murino servem como uma plataforma versátil para estudar os processos biológicos complexos ocorrem em calo ósseo e explorar novas estratégias terapêuticas que aceleram a regeneração do tecido ósseo.

Apesar das diferenças na estrutura óssea e metabolismo, o processo geral de fratura óssea cura permanece muito semelhante em camundongos e humanos, envolvendo uma combinação de endocondral e ossificação intramembranosa seguido de remodelação óssea. Ossificação endocondral envolve o recrutamento de células progenitoras para regiões menos mecanicamente estáveis em torno da gap de fratura, onde eles se diferenciar em condrócitos que hipertrofia e mineralize da cartilagem para produzir um calo mole. A segunda onda de células progenitoras infiltrar o calo e se diferenciam em osteoblastos maduros que secretam novo osso matriz^12,13,14,15. Durante a ossificação intramembranosa, progenitores na superfície periosteal e endosteal diretamente diferenciarem em matriz secretoras de osteoblastos e facilitam a ponte da fratura lacuna^{9,11,12 ,13}. Juntos, a endocondral e intramembranosa ossificações resultam no desenvolvimento de um calo duro, que é ainda mais remodelado ao longo do tempo para formar um osso secundário forte capaz de suportar cargas mecânicas^{13,14 ,15}. Em seres humanos saudáveis, o processo de cicatrização leva cerca de 3 meses, em comparação com apenas 35 dias em ratos¹⁶.

Consolidação da fratura foi comumente estudado usando qualquer modelos cirúrgicos abertos ou fechados,¹⁷. Abra as abordagens cirúrgicas, como a geração de um defeito de tamanho crítico ou completar a osteotomia, padronizar a localização da lesão e a geometria para reduzir os desvios causados por fraturas cominutivas. Osteotomias servem como um excelente modelo para estudar o mecanismo subjacente por trás de um não-União porque a cura é frequentemente atrasada em comparação com fraturas fechadas. Além disso, uma fixação rígida externa é necessária para estabilizar o osso osteotomized, significando que a regeneração dependerá principalmente da ossificação intramembranosa. Abordagens cirúrgicas abertas usam dispositivos tais como bloqueio de unhas, pin-clipes e placas de travamento para fornecer estabilidade axial e rotacional ao membro fraturado; no entanto, tais dispositivos são caros e requerem significativamente mais tempo na cirurgia^18,19,20,21. Por outro lado, modelos fechados são estabilizados com um dispositivo de fixação intramedular simples, permitindo a suficiente instabilidade estimular a cura endocondral. Como resultado, modelos de fratura fechada não facilmente imitar as condições de um não-sindicalizados. Técnicas de fixação interna, tais como pinos intramedular, pregos e parafusos de compressão, são vantajosas, como eles são mais barato, fácil de usar e minimizar o tempo de cirurgia^21,22,23. Em alguns casos, os pinos intramedulares são inseridos antes da fratura, mas da flexão do pino intramedular pode levar a angulação ou deslocamento do fêmur fraturado, contribuindo para um tamanho variável calo e cura. O local da fratura e geometria são mais difíceis de padronizar em modelos fechados, como eles são gerados usando um dispositivo de flexão de três pontos, onde um peso é cair na diáfise. No entanto, com a técnica adequada, esta abordagem cirúrgica oferece resultados rápidos e consistentes. Além disso, o modelo de fratura fechada serve como uma ferramenta clinicamente relevante para o estudo de fraturas causadas por força de alto impacto ou estresse mecânico²².

Este protocolo cirúrgico foi adaptado de métodos anteriormente descritos usando um pino intramedular para estabilizar a fraturadas fêmures de ratos e camundongos^22,24,25. Primeiro, uma agulha de haste intramedular de pequeno diâmetro é inserida através do entalhe de intracondylar para estabelecer um ponto de entrada, e um fio-guia é introduzido antes de gerar uma fractura transversal a femoral midshaft usando um três-ponto de gravidade-dependente dispositivo de dobra. Após a bem sucedida geração de uma fratura do fêmur fechada, uma haste intramedular de maior diâmetro é incorporada sobre o fio-guia para estabilizar o fêmur fraturado. Este método evita o risco de cicatrização causada pela angulação do pino intramedular durante a fratura, como a colocação da pós-fratura haste permite a estabilização de reposicionamento e otimizada do fêmur ferido.

Protocol

O procedimento a seguir foi realizado com a aprovação do Comitê de uso (IACUC) e Indiana universidade escola de medicina institucional Cuidado Animal. Todas as cirurgias de sobrevivência foram realizadas sob condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do NIH. Dor e risco de infecções eram geridas com adequada analgésicos e antibióticos para garantir um resultado positivo. 1. anestesia e preparação Pesar o mouse e anestesiá-lo com uma mistura de cetamina (100 …

Representative Results

O sucesso da implementação do procedimento cirúrgico foi monitorado com imagens radiográficas. Etapas-chave incluem a inserção de uma agulha de haste intramedular, a colocação de um fio-guia, a indução de uma fratura transversal no midshaft a femoral e a estabilização adequada com uma haste intramedular (Figura 2Aeu – 2Aiv). A progressão de cura do calo da fratura foi monitorada com imagens radiográficas semanai…

Discussion

O objetivo deste procedimento cirúrgico é gerar fraturas femorais fechadas padronizadas em camundongos. A principal vantagem desse modelo é que a fixação interna ocorre após a geração da fratura, evitando assim uma angulação da haste intramedular. Talvez o aspecto mais importante deste protocolo é a geração de uma fratura transversal padronizada no midshaft fêmur, como a geometria da fratura é dependente da força de flexão aplicada e o posicionamento do membro hind. Posicionamento incorreto do fêmur dur…

Materials

Oster Minimax Trimmer	Animal World Network	78049-100
POVIDONE-IODINE	Thermo Fisher Scientific	395516
OPHTHALMIC OINTMENT	Thermo Fisher Scientific	NC0490117
Styker T/Pump Warm Water Recirculator	Kent Scientific Corporation	TP-700
1ml Sub-Q Syringe	Thermo Fisher Scientific	309597
ENCORE Sensi-Touch PF	Moore Medical LLC	30347	Latex, powder-free surgical glove
PrecisionGlide 25G Hypodermic Needles	Thermo Fisher Scientific	14-826-49
Ultra-High-Temperature Tungsten Wire,	McMaster-Carr	3775K37	0.005" Diameter, 1/16 lb. Spool, 380' Long
304 stainless steel, 24G thin walled tubing	Microgroup Inc	304h24tw-5ft
#15 Scalpel Blades	Fine Science Tools	10015-00
#10 Scalpel Blades	Fine Science Tools	10010-00
Narrow Pattern Forceps	Fine Science Tools	11002-12	Serrated/Straight/12cm
Iris Forceps	Fine Science Tools	11066-07	1×2 Teeth/Straight/7cm
Dissector Scissors	Fine Science Tools	14081-09	Slim Blades/Angled to Side/Sharp-Sharp/10cm
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11	ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11.5cm
Olsen-Hegar Needle Holder with Suture Cutter	Fine Science Tools	12002-12	Straight/Serrated/12cm/with Lock
Crile Hemostat	Fine Science Tools	13004-14	Serrated/Straight/14cm
Tungsten Wire Cutter	ACE Surgical Supply Co., Inc.	08-051-90	ACE #150 Wire Cutter, tungsten carbide tips
3-0 VICRYL Suture	Ethicon Suture	J423H	3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING
piXarray 100 Digital Specimen Radiography System	Bioptics, Inc		Cabinet x-ray system
Einhorn 3-Point Bending Device	N/A	N/A	Custom Built