Summary

Una misura di cromatografia liquida ad alte prestazioni della chinurenina e acido chinurenico: materia biochimica di cognizione e di sonno in ratti

Published: August 19, 2018
doi:

Summary

Alterazioni in metaboliti neuroattivi kynurenine pathway (KP) sono implicate nelle malattie psichiatriche. Indagando i risultati funzionali di un alterato kynurenine pathway metabolismo in vivo nei roditori può contribuire a delucidare approcci terapeutici innovativi. L’attuale protocollo combina approcci biochimici e comportamentali per studiare l’impatto di una sfida di chinurenina acuta nei ratti.

Abstract

La via della chinurenina (KP) di degradazione del triptofano è stata implicata nei disturbi psichiatrici. In particolare, l’Astrocita-derivati metabolita acido chinurenico (KYNA), un antagonista sia N-metilico-d-aspartato (NMDA) e α7 recettori nicotinici per l’acetilcolina (α7nACh), è stato implicato nei processi cognitivi nella salute e nella malattia. Come i livelli di KYNA sono elevati nei cervelli dei pazienti con schizofrenia, un malfunzionamento al glutamatergic e recettori colinergici è creduto per essere causalmente a disfunzione conoscitiva, un dominio di nucleo della psicopatologia della malattia. KYNA può svolgere un ruolo patofisiologico significativo in individui con la schizofrenia. È possibile elevare endogeno KYNA nel cervello del roditore di trattare gli animali con la chinurenina diretto bioprecursor e studi preclinici in ratti hanno dimostrato che le altezze acute in KYNA possono influenzare i processi di apprendimento e memoria. L’attuale protocollo descrive questo approccio sperimentale in dettaglio e combina un) un’analisi biochimica della chinurenina nel sangue e cervello formazione KYNA (mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni), b) comportamentali test per sondare la memoria contestuale hippocampal-dipendente (paradigma di evitare passivo) e c) una valutazione del comportamento di sonno-veglia [telemetriche registrazioni che unisce l’elettroencefalogramma (EEG) e segnali di elettromiografia (EMG)] in ratti. Presi insieme, una relazione tra elevati KYNA, sonno e cognizione è studiata, e questo protocollo viene descritto in dettaglio un approccio sperimentale alla comprensione dei risultati di funzione di elevazione chinurenina e KYNA formazione in vivo nei ratti. Risultati ottenuti attraverso le variazioni di questo protocollo metterà alla prova l’ipotesi che il KP e KYNA servono ruoli chiave nella modulazione del sonno e la cognizione negli Stati di salute e malattia.

Introduction

Il protocollo di Kyoto è responsabile di degradante quasi il 95% del triptofano aminoacido essenziale1. Nel cervello di mammifero, chinurenina presa in astrocytes è metabolizzata in neuroattivi piccola molecola KYNA principalmente dall’enzima chinurenina aminotransferasi (KAT) II2. KYNA agisce come un antagonista dei recettori NMDA e α7nACh in cervello2,3,4, e anche obiettivi recettori inclusi il ricevitore arilico dell’idrocarburo (AHR) e la G-proteina di segnalazione accoppiato recettore 35 (GPR35)5 ,6. In animali da esperimento, le elevazioni in cervello KYNA sono state indicate per alterare la loro prestazione conoscitiva in una matrice di analisi comportamentale2,7,8,9,10 . Un’ipotesi emergente suggerisce che KYNA svolge un ruolo integrale nella modulazione delle funzioni cognitive di un impatto di comportamento di sonno-veglia11, sostenendo così ulteriormente il ruolo di molecole derivate da astrociti nella modulazione della neurobiologia del sonno e cognizione12.

Clinicamente, le elevazioni in KYNA sono state trovate nel liquido cerebrospinale e tessuto cerebrale post mortem da pazienti con schizofrenia13,14,15,16, un debilitante disturbo psichiatrico caratterizzata da disturbi cognitivi. I pazienti con schizofrenia sono anche spesso afflitti da disturbi del sonno che possono esacerbare la malattia17. Comprensione del ruolo del metabolismo di KP e KYNA nella modulazione di una relazione tra il sonno e cognizione, in particolare tra apprendimento e la memoria, può condurre allo sviluppo di nuove terapie per il trattamento di questi scarsi risultati nella schizofrenia e altro malattie psichiatriche.

Un metodo affidabile e coerenza per la misurazione dei metaboliti di KP è importante assicurare che le ricerche emergenti da varie istituzioni possono essere integrata nella comprensione scientifica della biologia di KP. Attualmente, descriviamo la metodologia per misurare chinurenina nel plasma del ratto e KYNA nel cervello del ratto mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il presente protocollo, che fa uso di una rilevazione fluorimetrica in presenza di Zn2 +, in primo luogo è stato sviluppato da Shibata18 e più recentemente adattato e ottimizzato per derivatizzare con 500 millimetri di acetato di zinco come il reagente post-colonna, consentendo la rilevazione di endogeno, quantità nanomolari di KYNA nel cervello11.

Per stimolare la produzione endogena di KYNA de novo come descritto nel presente protocollo, la chinurenina bioprecursor diretto viene iniettata intraperitonealmente (i.p.) in ratti. In combinazione con le valutazioni biochimiche per determinare il grado di produzione di KYNA, gli impatti di un chinurenina sfidano sulla memoria hippocampal-dipendente (paradigma di evitare passivo) e l’architettura di sonno-veglia (segnali EEG ed EMG) è anche indagate11. Una combinazione di queste tecniche consente lo studio dell’impatto biochimico e funzionale di un chinurenina sfida in vivo nei ratti.

Protocol

I nostri protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale dell’Università del Maryland e seguito guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso di animali da laboratorio. Nota: Ratti Wistar del maschio adulto (250 – 350 g) sono stati utilizzati in tutti gli esperimenti. Separata coorti di animali sono stati utilizzati per l’analisi biochimica, esperimenti comportamentali e registrazioni di sonno-veglia. Gli animali sono stati a…

Representative Results

Per convalidare l’uso di un’iniezione intraperitoneale chinurenina come metodo per elevare il cervello KYNA, è stata eseguita un’analisi HPLC del tessuto. Le curve standard (Figura 1) sono state costruite utilizzando il software associato e permesso per la quantificazione dei campioni di tessuto. Cromatogrammi rappresentativi per chinurenina e KYNA sono presentati nella Figura 2. Chinurenina è stata osservata in un periodo di c…

Discussion

Per una valutazione affidabile di KYNA nel cervello dopo somministrazione periferica chinurenina, è fondamentale per combinare e interpretare esperimenti biochimici e funzionali. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che permette nuovi utenti a stabilire efficaci metodi per misurare il plasma chinurenina e cervello KYNA dei ratti. La misura della chinurenina nel plasma ha confermato l’iniezione esatta e la misurazione del metabolita KYNA conferma la sintesi de novo nel cervello. Ci sono diversi vantaggi de…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Lo studio presente è stato in parte finanziato dal National Institutes of Health (R01 NS102209) e una donazione del Clare E. Forbes trust.

Materials

Wistar rats Charles River Laboratories adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) Dr. Maisch GmbH
EZ Clips Stoelting Co. 59022
Mounting materials screws PlasticsOne 00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures MedRep Express 699B CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures Ethicon J310H 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement Stoelting Co. 51458
Drill Bit Stoelting Co. 514551 0.45 mm
Name Company Catalog Number Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module Waters 176269503
2475 fluorescence detector Waters 186247500
post-column reagent manager Waters 725000556
Lenovo computer Waters 668000249
Empower software Waters 176706100
Name Company Catalog Number Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle MedAssociates ENV-018MD Interior: 22"W x 22"H x 16"D
Center channel modulator shuttle box chamber MedAssociates ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat MedAssociates ENV-010MB-GF
Auto guillotine door MedAssociates ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat MedAssociates ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel MedAssociates ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber MedAssociates ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package MedAssociates DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes MedAssociates ENV-253C
Infrared source and dectector array strips MedAssociates ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module MedAssociates ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module MedAssociates ENV-412
Dual A/B shock control module MedAssociates ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension MedAssociates SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F MedAssociates SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6 MedAssociates SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080D
PCI interface package MedAssociates DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package MedAssociates SOF-700RA-7
Name Company Catalog Number Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software Data Sciences International (DSI) PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface Data Sciences International (DSI) PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit Data Sciences International (DSI) 271-0112-013
Dell 19" computer monitor Data Sciences International (DSI) 271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x Data Sciences International (DSI) 272-6001-001
Cisco RV130 VPN router Data Sciences International (DSI) RV130
Matrix 2.0 Data Sciences International (DSI) 271-0119-001
Network switch Data Sciences International (DSI) SG200-08P
Neuroscore software Data Sciences International (DSI) 271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET Data Sciences International (DSI) 270-0134-001

References

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Citer Cet Article
Baratta, A. M., Viechweg, S. S., Mong, J. A., Pocivavsek, A. A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats. J. Vis. Exp. (138), e58129, doi:10.3791/58129 (2018).

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