Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent

Summary

Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull’espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.

Abstract

Cardiomiociti generati dalle cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC-CMs) sono uno strumento emergente nella ricerca cardiovascolare. Piuttosto che essere una popolazione omogenea delle cellule, l’iPSC-CMs generati da protocolli correnti di differenziazione rappresentano una miscela delle cellule con ventricolare-, atriale-e fenotipi nodale-like, che complica l’analisi fenotipiche. Qui, un metodo per registrare otticamente i potenziali di azione in particolare da ventricolare-come iPSC-CMs è presentato. Questo si ottiene attraverso la trasduzione lentivirale con un costrutto in cui un indicatore di tensione geneticamente codificato è sotto il controllo di un elemento promotore ventricolare-specifico. Quando iPSC-CMs vengono trasdotti con questo costrutto, il sensore di tensione è espresso esclusivamente in ventricolare-come le cellule, che permette registrazioni potenziali di membrana ottico sottotipo-specifici utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse.

Introduction

Cardiomiociti (CMs) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono uno strumento emergente di sezionare i meccanismi molecolari di malattia cardiaca, per studiare nuove terapie e allo schermo per avverse cardiache effetti^{1,2 ,3}. Fin dall’inizio, malattie aritmogene quali canalopatie sono stati un fuoco importante di questa ricerca zona⁴. Di conseguenza, metodi per studiare elettrici fenotipi di CMs, quali aritmie o cambiamenti di morfologie di potenziale di azione (AP), sono il cuore di questa tecnologia.

Una considerazione importante nell’applicazione della iPSC-CMs è che non provochino l’attuale protocolli di differenziamento cardiaco in una popolazione omogenea delle cellule. Invece, sono piuttosto una miscela di cellule che assomigliano al nodo seno atriale e ventricolare CMs a diversi livelli di maturazione^5,6,7,8. Questa eterogeneità può essere un’importante fonte di variabilità sperimentale, soprattutto se i parametri come la durata di AP (APD) sono studiati, che intrinsecamente differiscono tra sottotipi di CM (ad es., l’APD è più breve in atriale rispetto a CMs ventricolare). L’approccio convenzionale per affrontare questo problema è indagare singolo iPSC-CMs utilizzando il metodo di patch clamp e classificare ogni cella come nodale-, atriale-, o ventricolare-come, in base alle sue AP morfologia⁹. Qualsiasi analisi successiva possono essere quindi limitato alle cellule che rappresenta il sottotipo di CM di interesse. Il principale svantaggio di questa strategia è la limitata velocità effettiva e la mancanza di scalabilità. Inoltre, la natura invasiva della patch ed elettrofisiologia morsetto non consente l’imaging delle stesse cellule in sequenza a periodi di tempo estesi.

Qui, forniamo dettagli sperimentali su un metodo¹⁰ sviluppato per otticamente immagine APs in sottotipi specifici di iPSC-CMs. Questo supera il problema dell’eterogeneità di sottotipo e aumenta notevolmente la velocità di trasmissione rispetto ai metodi convenzionali, permettendo la rapida fenotipizzazione di iPSC-CMs che trasportano varianti genetiche o essere esposti a farmacologico agenti.

Panoramica dell’approccio imaging ottico sottotipo-specifici

Un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI), cui proprietà di fluorescenza cambi su depolarizzazione e ripolarizzazione della membrana cellulare, viene utilizzato per immagine otticamente cambiamenti del potenziale di membrana di CMs. La GEVI applicato qui è la proteina fluorescente-rilevamento della tensione VSFP-CR¹¹, che consiste di un dominio transmembrana di rilevamento tensione fuso ad un paio di un verde (trifoglio) e una proteina fluorescente rosso (mRuby2) (Figura 1A). A causa della vicinanza di due fluorophores, l’eccitazione della proteina fluorescente verde risultati in una frazione dell’energia di eccitazione viene trasferito alla proteina fluorescente rossa tramite trasferimento di energia per risonanza (FRET). Di conseguenza, l’eccitazione della proteina fluorescente verde si traduce in un’emissione da sia il verde e il rosse proteine fluorescenti (Figura 1A, pannello superiore). Quando la cella depolarizza, si verifica una riorganizzazione strutturale nel sensore di tensione che si traduce in un riorientamento delle due proteine fluorescenti, aumentando l’efficienza FRET. Così, ancora di più l’energia di eccitazione viene trasferito dal verde alla proteina fluorescente rossa (Figura 1A, pannello inferiore). Di conseguenza, in una cella depolarizzata, l’emissione di fluorescenza verde è dimmer, e l’emissione di fluorescenza rossa è più luminoso in una cella a riposo il potenziale di membrana (Figura 1B).

Figura 1: imaging ottico della membrana potenziale con VSFP-CR. (A), A schema raffigurante l’azione della proteina fluorescente tensione sensibile CHE VSFP-CR è indicato. Al momento la depolarizzazione della membrana cellulare, una riorganizzazione strutturale nel dominio del transmembrane-rilevamento della tensione si traduce in un riorientamento del verde (GFP) e rossa proteina fluorescente (RFP), aumentando l’efficienza del Förster intramolecolare trasferimento di energia per risonanza (FRET). Sono raffigurati gli spettri (B) l’emissione di un VSFP all’eccitazione della GFP in cellule presso il potenziale di membrana di riposo (pannello superiore) e in cellule depolarizzate (pannello inferiore). Il cambiamento spettrale su depolarizzazione è esagerato per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le modifiche dell’efficienza della FRET mirroring le fluttuazioni del potenziale di membrana sono Imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza equipaggiato con un’immagine splitter, che separa le emissioni di fluorescenza rossa e verde e li proietta su due zone adiacenti di il chip di una fotocamera sCMOS (Figura 2). Con questo set-up, l’emissione di fluorescenza a due bande di lunghezza d’onda differente possa essere registrato simultaneamente, che permette il calcolo di un rapporto di fluorescenza rosso-verde in modo da riflettere il potenziale in ogni immagine di una serie di time-lapse di membrana.

Figura 2: configurazione del sistema di imaging. I componenti principali del sistema di imaging utilizzata per immagine sono raffigurati i cambiamenti spettrali della proteina fluorescente tensione-sensibili del mirroring i cambiamenti di potenziale di membrana ad alta risoluzione temporale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

L’espressione di VSFP-CR in CMs è raggiunto attraverso la trasduzione lentivirale. Per indirizzare l’espressione per il sottotipo di CM di interesse, il lentivirus contiene un elemento di promotore (il rinforzatore di MLC2v ) che spinge in particolare trascrizione in ventricolare-come iPSC-CMs¹⁰. Quando l’iPSC-CMs che rappresentano una miscela di cellule simil-atriale, nodale-come e ventricolare-come vengono trasdotti con questo lentivirus, VSFP-CR è espressa solo nelle cellule simil-ventricolare. Poiché l’imaging ottico potenziale d’azione dipende da questo sensore fluorescente, i potenziali di azione registrati rappresentano esclusivamente il sottotipo di CM di interesse (Figura 3).

Figura 3: espressione del promotore-driven VSFP per l’imaging di potenziali di membrana sottotipo-specifici. (un) questo schema Mostra come sono realizzate le registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici del cardiomyocyte. (b) iPSC-CMs infettato da un VSFP sotto il controllo della ventricolare specifiche MLC2v-enhancer sono mostrati. L’espressione nel sensore di tensione è osservata solo in ventricolare-come CMs nel canale GFP (pannello di sinistra). A vostra disposizione anche il contrasto di fase (pannello centrale) e l’immagine di sovrapposizione (pannello di destra). Le linee bianche tratteggiate segnano confini delle cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. preparazione di cardiomiociti derivati iPSC per l’Imaging Nota: Metodi per la differenziazione di cultura e cardiaco iPSC sono apparse prima12,13,14 e non sono discussi qui in dettaglio. La purificazione di iPSC-CMs di microdissection manuale, separazione magnetica delle cellule o selezione di lattato è raccomandata, a seconda del protocollo di differenziazione utilizzato. Per il seguente protocollo…

Representative Results

In Figura 4a, un singolo rappresentante iPSC-CM è raffigurato con le linee bianche tratteggiate marcatura il ROI disegnato durante l’analisi di imaging RFP (lato sinistro) e il canale GFP (lato destro). Il segnale dal canale RFP Mostra un aumento periodico intensità fluorescente durante ogni potenziale di azione (Figura 4b, pannello superiore). Come descritto nell’introduzione, questo è a causa di un crescente apprensione caus…

Discussion

Il metodo qui descritto consente una registrazione ottica di APs da un sottotipo specifico (cioè, ventricolare-come le cellule) di CMs generato da iPSCs umane. Umano iPSC-CMs sono uno strumento emergente per affrontare una grande varietà di problemi biologici e medici, e la differenziazione di diversi sottotipi di CM è un’importante fonte di variabilità sperimentale. Utilizzando elementi specifici promotore, l’espressione di un GEVI è specificamente realizzato in CMs che rappresenta il sottotipo di interess…

Materials

ß-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
DMEM-F12 Medium	Invitrogen	21331046
FBS(Fetal Bovine Serum)	Invitrogen	16141079
MEM Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140050
GlutaMax-I Supplement	Invitrogen	35050061	alternative L-Glutamine
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
Fibronectin bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141
Collagenase type II	Worthington Biochem	LS004174
Hexadimethrine Bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268	enhancing lentiviral infection
3.5 cm glass-bottom microdishes	MatTek corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-14-C
Microscope stand	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	DMI6000B
Microscope objective	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil
sCMOS camera	Andor Technology, Belfast, UK	Zyla V
Microscope filter cube: excitation filter	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	ET480/40X	bandpass 480/40
Microscope filter cube: dichroic mirror	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	T505lpxr	longpass 505 nm
Image splitter	Cairn Research, Faversham, UK	OptoSplit II
Image splitter filter cube: dichroic mirror	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	568LPXR	longpass 568 nm
Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	520/28 BrightLine HC	bandpass 520/28 nm
Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission)	AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany	630/75 ET Bandpass	bandpass 630/75 nm
Pacing inset	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	RC-37FS