Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine ex Vivo Lunge Krebs Modell, die imitiert die Schritte der Tumorprogression und hilft, um einen Primärtumor zu isolieren, zirkulierende Tumorzellen und metastatischen Läsionen.

Abstract

Es ist schwierig, Tumorzellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Tumorprogression zu isolieren. Wir haben eine ex Vivo Lunge Modell, die das Zusammenspiel von Tumorzellen mit einer natürlichen Matrix und kontinuierlicher Strom an Nährstoffen zeigen kann, sowie ein Modell, das die Interaktion von Tumorzellen mit normalen zellulären Komponenten und eine natürliche Matrix zeigt. Die azellulären ex Vivo Lunge Modell wird durch eine Ratte Herz-Lungen-Block zu isolieren und entfernen alle Zellen, die mit dem Decellularization-Verfahren erstellt. Die rechten Bronchus abgebunden und Tumorzellen werden durch eine Spritze in der Luftröhre platziert. Die Zellen bewegen und die linke Lunge zu füllen. Die Lunge befindet sich dann in einem Bioreaktor, der Lungenarterie einen kontinuierlichen Fluss von Medien in einem geschlossenen Kreislauf erhält. Der Tumor auf die linke Lunge angebaut ist der Primärtumor. Die Tumorzellen, die in den zirkulierenden Medien isoliert werden Tumorzellen im Umlauf sind und die Tumorzellen in der rechten Lunge sind metastatischen Läsionen. Das zelluläre ex Vivo Lunge Modell entsteht durch das Auslassen des Decellularization-Prozesses. Jedes Modell kann verwendet werden, um verschiedene Forschungsfragen zu beantworten.

Introduction

Krebsmetastasen ist der Schuldige hinter den meisten krebsbedingte Todesfälle und stellt die ultimative Herausforderung bei den Bemühungen zur Bekämpfung von Krebs. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Protokoll für eine vierdimensionale (4D) Zellkultur zu entwerfen, die eine Dimension des Flusses, neben dem dreidimensionalen (3D) Zelle Wachstum hat. Es steht für die drei Phasen des Prozesses Metastasen [d.h., der Primärtumor, zirkulierende Tumorzellen (CTC) und metastatischen Läsionen].

In den letzten drei Jahrzehnten brachte Wissenschaftler auf der ganzen Welt eine unvergleichliche Fülle von Informationen zu verstehen, die Mechanismen der metastatischen Progression bei verschiedenen Krebsarten, die die Aussicht auf eine Heilung oder progressionsfreie Überleben verbessert. Deutlich verbessert die klinische Behandlung von einigen Krebsarten wie Brustkrebs,¹; Einige Krebsarten wie Lungenkrebs, haben jedoch noch eine schlechte überleben². In Vitro und in Vivo Tiermodellen haben maßgeblich bei der Schaffung von neuen Erkenntnisse über die Mechanismen, die die Entwicklung der Krankheit zugrunde liegen. In den letzten Jahren Zell-Linie abgeleitet Xenotransplantate (CDX) und Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDX) wurden von größerem Interesse, da sie viele relevanten Merkmale des menschlichen Primärtumor³, z. B. Wachstum Kinetik, histologischen Merkmale, Verhalten bewahren Merkmale und das Ansprechen auf die Therapie. Jedoch hat jedes Modell seine Grenzen zum Verständnis des Mechanismus der CTC-Bildung und Metastasen in entfernten Organ^4,5,6.

Vor kurzem haben wir ein 4-D- ex Vivo Lunge Krebs Modell durch die Verwendung von des Konzepts der Orgel reengineering und Perfusions-basierte Zellkultur entwickelt. Es ahmt die menschliche Lunge-Krebs-Wachstum durch die Bildung von perfusable Tumor Knötchen, die im Laufe der Zeit, mit einem ähnlichen menschlichen Krebs abgesondert wachsen Protein Produktion⁷. Es repräsentiert die Gen-Ausdruck-Signatur, die prognostiziert schlechte Überlebensrate bei Patienten mit Krebs und zeigt auch eine therapeutische Antwort von Tumor-Regression auf Cisplatin Behandlung^8,9. Die Lunge-Modell wurde weiter modifiziert, so dass es metastatische Läsionen bilden kann. Die CTCs entwickeln sich aus einem Primärtumor und Intravasate in das Gefäßsystem und Leber in die kontralaterale Lunge metastatischen Läsionen¹⁰zu bilden. Genexpressionsstudien empfehlen eine ausgeprägte Expressionsprofil des Primärtumors, CTCs, und die metastatischen Läsionen und die Hochregulation der Teilmenge von Genen, die für den Phänotyp¹⁰erforderlich. Dieser metastatischen Prozess erfolgt aufgrund des Vorhandenseins von biologischen Bedingungen bei Patienten mit Krebs gesehen. Der Vorteil dieses Modells ist das Vorhandensein einer natürlichen Matrix und Architektur und eine Perfusion der Nährstoffe, die zur Bildung von Knötchen Tumor führt. Darüber hinaus gibt es auch Gelegenheit, die Auswirkungen der verschiedenen Komponenten des Tumors Mikroumgebung oder Drogen auf Tumorprogression im Laufe der Zeit zu studieren. Dieses Modell kann verwendet werden, um einen Zellbereich Krebs (Lungenkrebs, Brustkrebs, Sarkom etc.) in einem Labor zu wachsen.

Protocol

Die Protokolle für Tierversuche wurden durch die institutionelle Animal Care and Use Committee am Houston Methodist Research Institute genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit allen Vorschriften, Gesetze, Richtlinien und Richtlinien. 1. Rat Lunge Ernte Ein 4 bis 6 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley Ratten durch eine intraperitoneale (IP) Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) in seine Flanke zu betäuben. Narkose durch die Suche nach einer Abwesenhe…

Representative Results

Die Lunge von Ratte geerntet unterhält die intakte Gefäßsystem Alveolen11 (Abb. 3A und 3 b). Auf Decellularization sind die extrazelluläre Matrix Komponenten eine azelluläre Lunge, wie Kollagen, Fibronektin und Elastin,11 (Abbildung 3, 3D, 3Eund 3F) erhalten. Die Decellularization führt zu eine vollständige E…

Discussion

Die ex-Vivo 4-D Lunge bietet die Möglichkeit, Tumorwachstum und Metastasierung in einem Labor zu untersuchen. Eine native Lunge-Matrix ist ein komplexes System, das unterstützt normalgewebe und Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Matrix Interaktionen, Zelldifferenzierung und Gewebe Organisation unterhält. Es bietet Gelegenheit, fügen Sie jeder Tumor Mikroumgebung Komponenten, um ihre Auswirkungen auf das Tumorwachstum und die Interaktion mit anderen Zellen zu studieren.

Die Lunge-Ernte…

Materials

Sprague Dowley rat	Harlan	206M	Male
Chlorhexidine swab	Prevantics, NY, USA	NDC 10819-1080-1
Heparin	Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA	NDC 25021-400-10
18-gauge needle	McMaster Carr, USA	75165A249
2-0 silk tie	Ethicon, San Angelo, TX, USA	A305H
Masterflex L/S pump	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07554-80
Masterflex L/S pump head	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-05
Masterflex L/S pump cartridge	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-07519-70
Tygon Tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	14171211
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-16
Female luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-34	75165A249
Male luer lock connectors	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45513-04
black nylon ring	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	EW-45509-04
Intravenous set	CareFusion	41134E
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	CAS151-21-3
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Antibiotics	Gibco	15240-062
Silicone oxygenator	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	ABW00011	Saint-GoBain-
Wire mesh	1164610105	Lowes	New York Wire
Female luer Lug Style TEE	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-56
Male luer integral lock ring to 200series Barb	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45518-08
Female luer thread style coupler	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	45508-22
Clave connector	ICU Medical	11956
Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock	smith Medical	MX9341L
MasterFlex Pump tube	Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA	06598-13	for cannula