Un dosage de haut-débit-flux de Calcium pour l’étude des récepteurs NMDA avec sensibilité à la Glycine/D-sérine et Glutamate
Summary
Le but du présent protocole est de faciliter l’étude des récepteurs NMDA (NMDAR) à grande échelle et de permettre l’examen des effets modulateurs de petites molécules et leurs applications thérapeutiques.
Abstract
Les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) (NMDAR) sont classés comme des récepteurs de glutamate ionotropiques et ont un rôle essentiel dans l’apprentissage et la mémoire. Dysfonctionnement des NMDAR, exprimé comme soit plus – ou moins – sous‑activité causée par des mutations, une expression altérée, trafic ou la localisation, peut contribuer à nombreuses maladies, en particulier dans le système nerveux central. Comprendre la biologie du récepteur mais aussi de faciliter la découverte de composés et de petites molécules est donc crucial dans les efforts visant à lutter contre les maladies neurologiques. Les approches actuelles à l’étude du récepteur ont des limites y compris de faible débit, coût élevé et l’impossibilité d’étudier ses capacités fonctionnelles dues à la présence nécessaire des bloqueurs de canaux afin d’empêcher l’excitotoxicité médiée par NMDAR. En outre, les systèmes de dosage sont sensibles à la stimulation par le glutamate seulement et manquent de sensibilité à la stimulation par la glycine, le ligand autre co de la NMDAR. Nous présentons ici le premier dosage basé sur plaque avec puissance de haut débit afin d’étudier un récepteur NMDA avec sensibilité à la fois des ligands CO, glutamate et D-sérine/glycine. Cette approche permet l’étude de différentes compositions de sous-unité NMDAR et permet des études fonctionnelles du récepteur en modes glycine – et/ou sensibles au glutamate. En outre, la méthode ne requiert pas la présence d’inhibiteurs pendant les mesures. Les effets de MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs et négatifs peuvent être détectées avec ce dosage et la pharmacologie connue des NMDAR a été reproduite dans notre système. Cette technique permet de surmonter les limites des méthodes existantes et est rentable. Nous pensons que cette nouvelle technique permettra d’accélérer la découverte de thérapies pour des pathologies NMDAR-mediated.
Introduction
Avec les progrès actuels en médecine, l’espérance de vie a augmenté de façon significative ; Toutefois, il a donc la prévalence des maladies liées au vieillissement. Maladies du système nerveux central (CNS) tels que la schizophrénie, sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie d’Alzheimer et de Parkinson, entre autres, ne font pas exception et ont été devrait pour augmenter au cours de la prochaine décennie1, 2 , 3. le défaut de fonctionnement des récepteurs du glutamate ionotropiques appelés récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) a été liée à la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, traumatisme crânien, accident vasculaire cérébral, diabète et glaucome parmi d’autres, qui garantit la besoin d’étudier leur biologie pour le développement de thérapies efficaces, modificateurs4,5,6,7.
Récepteurs NMDA est composées de quatre monomères ou sous-unités4,8,9. La composition structurelle de la NMDAR montre la variabilité régionale et de développementale dans le cerveau7,10. Récepteurs NMDA est impliqués dans la plasticité synaptique, la cognition et la génération des rythmes respiratoires et locomotion11,12,13. Comme un canal de voltage-dépendants, c’est en grande partie non conducteur à potentiel membranaire de repos (-70 mV) et est bloquée par le magnésium pour prévenir d’autres perméation des ions. Le canal est activé par la liaison de deux ligands, glutamate et glycine/D-sérine et une dépolarisation simultanée au niveau de la membrane synaptique médiée par les récepteurs AMPA, une autre sous-classe des récepteurs ionotropiques du glutamate. La dépolarisation supprime le blocage de magnésium de la NMDAR, permettant l’afflux des cations, en particulier calcium14,15,16. Même si l’activation des NMDAR est essentielle pour la survie des cellules, activation excessive peut conduire à la mort17,18,19 à l’excitotoxicité de cellules. Cela, en plus de la nature complexe du récepteur, fait qu’il est difficile d’effectuer des études nécessaires au développement de thérapies efficaces.
Différentes méthodes ont été développées pour étudier le NMDAR. Cependant, chacun a accompagnant les mises en garde. Par exemple, une technique largement utilisée est un test par fluorescence qui mesure les changements NMDAR en calcium intracellulaire dans une lignée cellulaire stable sous le contrôle d’un promoteur inductible par la tétracycline (Tet-On)20. Cependant, dans ce système, les concentrations de supramaximal de ligands qui sont nécessaires et l’exigence que les inhibiteurs NMDAR sont présents lors de la mesure rend presque impossible de détecter l’activité de l’antagoniste compétitif. Dans d’autres systèmes similaires, l’expression du récepteur fonctionnel provoque la toxicité, exigeant que les bloqueurs des canaux calciques comme la kétamine21,22 , afin de préserver les cultures cellulaires. Ces inhibiteurs des canaux calciques s’asseoir au centre du récepteur et sont difficiles à laver, surtout dans un format de plaque, afin qu’ils interfèrent avec des études fonctionnelles du récepteur. Enfin, des mesures électrophysiologiques comme correctif de serrage, il y a un débit limité, en études à grande échelle sont très cher23. Nonobstant, les systèmes ci-dessus sont insensibles à la stimulation de la glycine ; étude de l’activité de la glycine-dépendante de la NMDAR devient donc un défi.
Nous décrivons ici une nouvelle approche pour l’étude de NMDAR qui surmonte les limites discutés. Notre technique capitalise sur le système d’expression baculovirus pour exprimer le récepteur au niveau fonctionnel avec un rapport optimal des sous-unités en aussi peu que 16 heures. Par ailleurs, l’utilisation de baculovirus permet une approche simple et combinatoire, qui prévoit une large caractérisation des sous-types distincts recombinants NMDAR. Contrairement à d’autres épreuves, ce protocole ne nécessite pas de bloqueurs des canaux calciques en raison de l’utilisation des antagonistes des faibles. Les plus fort avantage de la méthode est qu’après sevrage de l’antagoniste faible, le récepteur est sensible à la modulation des sites individuelle glycine-glutamate-liaison et en plus double modulation de glycine/D-sérine et glutamate ligands sites. Le dosage récapitule la pharmacologie connue du récepteur NMDAR et les effets de ses modulateurs positifs et négatifs connus. Enfin, génération de ce test cellulaire in vitro surmonte la toxicité cellulaire provoquée par l’influx de calcium excessif et permet des études fonctionnelles du récepteur dans un mode haut débit, qui peut accélérer les découvertes des modulateurs NMDAR dans les États de la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La réussite de ce test dépend largement de la santé des cellules HEK utilisé. Les cellules en croissance exponentielle et au nombre de passage bas doit être utilisé. Ce test comporte de nombreux transferts et ajouts des solutions, donc attention, en utilisant assurera une plus grande précision dans ses résultats. Les concentrations de composés et de tous les autres réactifs doivent être également une vérification croisée afin de minimiser les erreurs. Lors du remplacement des milieux cellulaires avec le tam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier le Post baccalauréat Scholars Program Office et Novartis Institutes for BioMedical Research dans son ensemble pour le financement de cette étude.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
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