En hög genomströmning kalcium-flux-analysen att studera NMDA-receptorer med känslighet för glycin/D-serine och glutamat
Summary
Målet med detta protokoll är att underlätta studiet av NMDA-receptorer (NMDAR) i större skala och låta granskningen av immunmodulerande effekter av små molekyler och deras terapeutiska tillämpningar.
Abstract
N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorer (NMDAR) klassificeras som jonotropa glutamatreceptorer och har viktiga roller i inlärning och minne. NMDAR funktionsfel, uttryckt som antingen över – eller under – activity orsakade av mutationer, förändrad uttryck, människohandel eller lokalisering, kan bidra till många sjukdomar, särskilt i det centrala nervsystemet. Därför är förståelse receptorns biologi samt underlätta upptäckten av föreningar och små molekyler avgörande i pågående ansträngningar att bekämpa neurologiska sjukdomar. Nuvarande metoder att studera receptorn har begränsningar inklusive låg genomströmning, höga kostnader och oförmågan att studera dess funktionella förmågor på grund av kalciumantagonister nödvändigt att förhindra att NMDAR-medierad excitotoxicitet. Dessutom de befintliga systemen för analysen är känsliga för stimulering av glutamat bara och saknar känslighet för stimulering av glycin, annan samtidig liganden av NMDAR. Här presenterar vi den första plattan-baserad analysen med hög genomströmning makt att studera en NMDA-receptorn med känslighet för både Co ligander, glutamat och D-serin/glycin. Detta tillvägagångssätt kan studiet av olika NMDAR subenhet kompositioner och funktionella studier av receptorn i glycin- eller glutamat-känsliga lägen. Metoden kräver dessutom inte förekomsten av hämmare under mätningarna. Effekterna av positiva och negativa Allosteriska modulatorer kan upptäckas med denna analys och den kända farmakologin för NMDAR har replikerats i vårt system. Denna teknik övervinner begränsningarna i befintliga metoder och är kostnadseffektiv. Vi anser att denna nya teknik kommer att påskynda upptäckten av terapier för NMDAR-medierade sjukdomar.
Introduction
Med aktuella framsteg inom medicin, har medellivslängden ökat betydligt. dock så har förekomsten av åldersrelaterade sjukdomar. Sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) som schizofreni, amyotrofisk lateralskleros (ALS), Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom, bland annat är inget undantag och har varit beräknas öka under nästa årtionde1, 2 , 3. fel på jonotropa glutamatreceptorer kallas N-metyl-D-aspartat receptorer (NMDAR) har kopplats till Alzheimers sjukdom, schizofreni, traumatisk hjärnskada, stroke, diabetes och glaukom bland annat som garanterar den behöver du studera deras biologi för utvecklingen av effektiva, sjukdomsmodifierande terapier4,5,6,7.
NMDARs består av fyra monomerer eller subenheter4,8,9. NMDAR strukturella sammansättning visar utvecklingsmässiga och regionala variationer inom de hjärna7,10. NMDARs är involverade i synaptisk plasticitet, kognition och genereringen av rytmer för andning och locomotion11,12,13. Som en spänningskänsliga kanal, är det till stor del icke-dirigering vid vila membranpotential (-70 mV) och blockeras av magnesium för att förhindra ytterligare genomträngning av joner. Kanalen aktiveras av bindningen av två ligander, glutamat och glycin/D-serine, och en samtidig depolarisation på synaptiska membranet medieras av AMPA-receptorer, en annan underklass av jonotropa glutamatreceptorer. Depolarisation tar bort magnesium blockeringen av de NMDAR, möjliggör inflödet av katjoner, särskilt kalcium14,15,16. Även om aktivering av NMDAR är avgörande för cellöverlevnad, kan Överdriven aktivering leda till cell död17,18,19 genom excitotoxicitet. Detta, gör utöver den komplicerade karaktären av receptorn, det utmanande för att utföra studier behövs för att utveckla effektiva behandlingar.
Olika metoder har utvecklats för att studera NMDAR. Var och en har dock kompletterande varningar. Exempelvis är en allmänt använd teknik en fluorescens-baserad analys som mäter NMDAR-medierad förändringar i intracellulära kalcium i en stabil cellinje under kontroll av en tetracyklin-inducerbara promotor (Tet-On)20. Dock i detta system gör supramaximal koncentrationerna av ligander som behövs och kravet att NMDAR-hämmare finns under mätningen det nästan omöjligt att upptäcka aktivitet av den kompetitiv antagonisten. I andra liknande system orsakar uttrycket av den funktionella receptorn toxicitet, som kräver kalciumantagonister såsom ketamin21,22 att bevara cellkulturer. Dessa kalciumantagonister sitta kärnan i receptorn och är svåra att tvätta ur, särskilt i en tallrik-baserat format, så de stör funktionella studier av receptorn. Slutligen i elektrofysiologiska mätningar såsom patch fastspänning, det finns begränsad genomströmning och storskaliga studier är mycket dyra23. Trots är de ovan system okänslig för glycin stimulering; Därför blir studerar glycin-beroende aktivitet av NMDAR en utmaning.
Här beskriver vi en ny metod för att studera NMDAR som övervinner de diskuterade begränsningarna. Vår teknik kapitaliserar på baculoviridae uttryck systemet uttrycka receptorn på funktionella nivåer med en optimal förhållandet av subunitsna i så lite som 16 timmar. Dessutom möjliggör användningen av baculoviridae en enkel och kombinatoriska strategi, vilket ger en bred karakterisering av distinkta rekombinant NMDAR undertyper. Till skillnad från andra analyser kräver detta protokoll inte kalciumantagonister på grund av användningen av svag antagonister. Metodens starkaste fördel är att efter bortspolning av svaga antagonist, receptorn är känslig för modulering av de enskilda glycin – och glutamat-bindande platserna utöver dubbla modulering av både glycin/D-serine och glutamat ligand-bindande platser. Analysens recapitulates känd farmakologi av NMDAR-receptorn och effekterna av dess kända positiva och negativa modulatorer. Slutligen, generation av denna i vitro cellulära analys övervinner cellulär toxicitet orsakad av överdriven kalcium tillströmning och möjliggör funktionella studier av receptorn i en hög genomströmning mode, som kan accelerera upptäckter av NMDAR modulatorer vid sjukdomstillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Framgången för denna analys beror på hälsan hos de HEK celler används. Celler som genomgår exponentiell tillväxt och med låg passage nummer ska användas. Denna analys innebär många överföringar och tillägg av lösningar, så använder försiktighet kommer att säkerställa högre noggrannhet i dess resultat. Koncentrationer av föreningar och alla andra reagens bör även dubbelkontrollera att minimera fel. När du ersätter cellen media med Analysbuffert för kalcium flux analysen, bör plattan lutas förs…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka de postkontor studentexamen Scholars Program och Novartis forskningsinstitut för biomedicinsk forskning som helhet för att finansiera denna studie.
Materials
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease–systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging–need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
