منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.
Summary
Spp. السالمونيلا هيدوسنتاريا spp. مسببات الأمراض الشائعة المنسوبة إلى الإسهال. هنا، يمكننا وصف منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. بكر في الوقت الحقيقي باستخدام جنبا إلى جنب مع الثقافة المصحوبة بمرشدين.
Abstract
انتقال البراز عن طريق الفم لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد يحدث من وقت لآخر، خاصة عندما يصاب الناس الذين يتناولون الطعام والماء من السالمونيلا spp./Shigella spp. الأسلوب معيار الذهب للكشف عن السالمونيلا spp./Shigella spp. الثقافة مباشرة لكن هذا ذات العمالة الكثيفة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، يصف لنا منبرا الفائق السالمونيلا spp./Shigella spp. الفحص، واستخدام الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) جنبا إلى جنب مع الثقافة المصحوبة بمرشدين. هناك مرحلتان الرئيسية: PCR الوقت الحقيقي والثقافة المصحوبة بمرشدين. للمرحلة الأولى (PCR الوقت الحقيقي)، ونحن شرح كل خطوة من الأسلوب: عينة جمع واستخراج الحمض النووي وتخصيب اليورانيوم قبل PCR الوقت الحقيقي. إذا كانت نتيجة PCR الوقت الحقيقي الإيجابي، ثم يتم تنفيذ المرحلة الثانية (ثقافة الإرشادية): ثقافة انتقائية، والبيوكيميائية تحديد وتوصيف المصلية. نحن أيضا توضيح الممثل النتائج المتولدة عن ذلك. البروتوكول هو موضح هنا سيكون منبرا قيماً لفحص سريعة ومحددة، وحساسة والفائق السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.
Introduction
الإسهال لا تزال قضية صحية مشتركة مع حدوث ارتفاع معدل عالمياً1،2. على الرغم من أن معدل وفيات منخفض نسبيا، إظهار بعض المرضى أعراض مختلفة لمدة أسابيع (مثل مائي وفضفاضة البراز، ملحة للذهاب إلى الحمام)، التي تجعل الأثر الاجتماعي-الاقتصادي عالية جداً3،4. الأخطر من ذلك، بعض المرضى قد حتى وضع القولون العصبي إذا ما تركت دون علاج5. وهناك أنواع مختلفة من البكتيريا والفيروسات والطفيليات التي يمكن أن تسبب الإسهال6. Spp. السالمونيلا دوسنتاريا spp. هي بين البكتيريا الأكثر شيوعاً لانتقال العدوى من التهاب المعدة والأمعاء الحاد7،،من89،،من1011. ولذلك، قد أصدرت العديد من المقاطعات القوانين أو الأنظمة العادية السالمونيلا spp./spp.دوسنتاريا الفرز بين الناس الذين سيكون التعامل مع المواد الغذائية والمياه. على سبيل المثال، أن الحكومة الصينية قد أصدرت قوانين إلزامية السالمونيلا spp./spp.دوسنتاريا الفحص مرة واحدة في سنة.
طريقة معيار الذهب السالمونيلا spp. هو كشف spp.دوسنتاريا البكتيريا الثقافة. من خلال الثقافة البكتيريا وتحديد البيوكيميائية المتعاقبة وتوصيف المصلية، يمكننا تحديد هذه أنواع البكتيريا، والتي يمكن أن تسهل إدارة تفشي الأمراض والميكروبات التنميط للمساعدة في علاج المرضى 12-يمكن أن يساعد أيضا تتبع مصدر العدوى خلال spp. السالمونيلا /دوسنتاريا spp. اندلاع13. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو كثيفة العمالة (التي تتطلب عملية يدوية) وتستغرق وقتاً طويلاً (عدة أيام أخذ)، خاصة بالنسبة لاختبار عدد كبير من العينات7. وعلاوة على ذلك، قابلة للتطبيق ولكن غير كولتورابل (فبنك) السالمونيلا spp./قد تكون موجودة في بعض عينات البرازدوسنتاريا spp.14. ونظرا لهذه العيوب، حاولت العديد من المختبرات لتطوير تقنيات جديدة للكشف عن السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.15،16،،من1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25-كل هذه الأساليب استخدام اختبار تضخيم الحمض النووي (NAAT)، بينها البلمرة المتسلسل (PCR) هو الأكثر شيوعاً. هو القيد الرئيسي واحد من هذه الأساليب NAAT على أساس أن الميت البكتيريا، الحطام حتى البكتيرية المحتوية على ناقصة الحمض النووي، يمكن أن تظهر نتائج إيجابية26، التي يمكن أن تؤثر إلى حد كبير في التشخيص الدقيق للمرض. وأظهرت بلانكو et al. أن المقايسة الجزيئية حساسة للغاية، ليس فقط لصالحه السالمونيلا في الثقافات، ولكن أيضا للجينوم جزئية وبكتيريا ميتة أو غير قادرة على البقاء من الالتهابات الماضية أو تلوث26. ولذلك، ينبغي تطوير تكنولوجيا جديدة.
هنا، يمكننا وصف أسلوب رواية أن يجمع NAAT أساس الأسلوب واستزراع. كما هو مبين في الشكل 1، يطبق هذا الأسلوب الجديد PCR الوقت الحقيقي الفرز الأولى وثم يتم إرسال عينات إيجابية للبكتيريا الثقافة والهوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp. غالباً ما تكون مقترنة بالتسمم الغذائي وانتقال البراز عن طريق الفم لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد28،29 والأسلوب الروتيني أما كثيفة العمالة أو تستغرق وقتاً طويلاً 7، يصف لنا منهاج spp. السالمونيلا الفا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمه العلم والبرنامج تشوهاى التكنولوجيا، الصين (المنحة رقم 20171009E030064) والعلم وبرنامج التكنولوجيا في قوانغدونغ، الصين (المنحة رقم 2015A020211004) والعلوم والتكنولوجيا لإدارة البرنامج العام الرقابة على الجودة والتفتيش والحجر الصحي للجمهورية الشعبية للصين (المنحة رقم 2016IK302، 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
References
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
- Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
- Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
- Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
- Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
- Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
- Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
- Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
- Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact–United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
- Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
- Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
- Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, 93-100 (2005).
- Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
- Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
- Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
- Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
- Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
- Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
- Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
- Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
- Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
- Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
- Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
- Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
- Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
- Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana–salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
- Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water – United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
- Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
- Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
- Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
- Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
- Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).
