Salmonella sppShigella spp., son patógenos comunes atribuidas a la diarrea. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.
En este artículo
Resumen
Resumen
Transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda ocurre de vez en cuando, especialmente cuando las personas que manejan alimentos y agua están infectadas por Salmonella spp./Shigella spp. El método estándar de oro para la detección de Salmonella spp./Shigella spp es cultura directa pero esto es desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva. Aquí, describimos una plataforma de alto rendimiento para Salmonella spp./Shigella spp de detección, usando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) combinada con cultura guiada. Hay dos etapas principales: la cultura guiada y PCR en tiempo real. Para la primera etapa (PCR en tiempo real), se explica cada paso del método: la muestra recogida, previo enriquecimiento, extracción de ADN y PCR en tiempo real. Si el resultado PCR en tiempo real es positivo, entonces se realiza la segunda etapa (cultura guiada): cultivo selectivo, identificación bioquímica y serológica caracterización. También ilustramos resultados representativos generados de él. El protocolo descrito aquí sería una plataforma valiosa para la detección rápida, específica, sensible y de alto rendimiento de Salmonella spp. /Shigella spp.
Introducción
La diarrea es aún un problema de salud común con una incidencia alta tasa global1,2. Aunque la mortalidad es relativamente baja, algunos pacientes muestran varios síntomas durante semanas (por ejemplo, las heces blandas y acuosas, una urgencia para ir al baño), que hacen que el impacto socioeconómico muy alto3,4. Más grave aún, algunos pacientes incluso pueden desarrollar síndrome de intestino irritable si se deja sin tratar5. Hay varias clases de bacterias, virus y parásitos que pueden causar diarrea6. <....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El protocolo sigue los lineamientos establecidos por el Comité de ética de investigación de Zhuhai International Travel Healthcare Center. Utilice estándar operación estéril durante el experimento.
1. preparación y composición de los medios de cultivo
- Preparar el caldo nutritivo: Disolver la peptona 1%, extracto de carne de res de 0.3%, cloruro de sodio 0,5%, glucosa 0.1% en H2O, ajustar el pH a 7,5 y autoclave en 121 ° C durante 15 minutos.
- Preparar medio de selenito cistina: disolver la peptona 0.5%, 1% Na2HCO3, 0.4% de lactosa, selenito de hidrógeno de sodio 0.4%, 0,001% L-cistina en H....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Se aplicó el protocolo para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp en heces anal muestras de personas que se manejan alimentos y agua.
En el paso de la PCR en tiempo real, como se muestra en la figura 5A, hubo una amplificación exitosa en canal HEX, que significó que la muestra mezclada era positiva para Salmonella spp. Luego se realizó una PCR en t.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Desde Salmonella sppShigella spp. a menudo se asocian a la intoxicación alimentaria y transmisión fecal-oral de gastroenteritis aguda28,29 y el método de rutina es desperdiciador de tiempo o mano de obra intensiva 7, se describe una plataforma de alto rendimiento para la Salmonella spp. / detección deShigella spp., utilizando PCR en tiempo real combinado con cultura guiada.
Ha.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la ciencia y tecnología programa de Zhuhai, China (concesión número 20171009E030064), la ciencia y tecnología programa de Guangdong, China (concesión número 2015A020211004) y ciencia y programa de Administración General de tecnología de supervisión de calidad, inspección y cuarentena de la República Popular de China (número de concesión 2016IK302, 2017IK224).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premezcla) | Takara | R040Q | |
| Caldo de nutrientes | LandBridge | CM106 | |
| Agar nutriente | LandBridge | CM107 | |
| Medio de selenita cistina | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella agar cromogénico | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella suero de diagnóstico | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella suero de diagnóstico | Tianrun | SHI54 | |
| hisopo anal (tubo colector plus) | Huachenyang | ||
| portaobjetos | Mingsheng | 7102 | |
| micro-bucle | Weierkang | W511 | |
| incubadora | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| baño seco | Jinghong | KB-20 | |
| sistema automatizado de identificación microbiana | bioMé Se podría utilizar rieux | VITEK2 | se podría utilizar otro sistema equivalente |
| , se podría utilizar la máquina de PCR fluorescente en tiempo real | ThermoFisher | ABI7500 | máquina equivalente |
Referencias
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in G....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
