Syntese og karakterisering af placenta Chondroitin sulfat en (plCSA) - målretning Lipid - Polymer nanopartikler
Summary
Vi præsenterer her, en protokol til syntese af placenta chondroitin sulfat A bindende peptid (plCSA-BP)-konjugeret lipid-polymer nanopartikler via trinvis ultralydbehandling og bioconjugate teknikker. Disse partikler udgør en roman redskab til målrettet levering af therapeutics til mest humane tumorer og placenta trophoblasts til behandling af kræft og placenta lidelser.
Abstract
En effektiv kræft terapeutiske metode reducerer og eliminerer tumorer med minimal systemisk toksicitet. Aktivt målretning nanopartikler tilbyder en lovende tilgang til kræftbehandling. Glykosaminoglykan placenta Chondroitinsulfat en (plCSA) er udtrykt på en bred vifte af kræftceller og placenta trophoblasts og malaria protein VAR2CSA kan specifikt binder sig til plCSA. En rapporteret placenta chondroitin sulfat A bindende peptid (plCSA-BP), afledt af malaria protein VAR2CSA, kan også specifikt binder sig til plCSA på kræftceller og placenta trophoblasts. Derfor kunne plCSA-BP-konjugeret nanopartikler bruges som et redskab til målrettet medicinafgivelse menneskelige kræftformer og placenta trophoblasts. I denne protokol beskriver vi en metode til at syntetisere plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler fyldt med doxorubicin (plCSA-DNPs); Metoden består af en enkelt sonikering trin og bioconjugate teknikker. Derudover er flere metoder til at karakterisere plCSA-DNPs, herunder fastsættelsen af fysisk-kemiske egenskaber og cellulære optagelse af placenta choriocarcinoma (JEG3) celler, beskrevet.
Introduction
En effektiv kræft terapeutiske metode reducerer og eliminerer tumorer med minimal systemisk toksicitet. Dermed er selektiv tumor målretning nøglen til at udforske vellykket terapeutiske metoder. Nanopartikler giver en lovende mulighed for kræftbehandling, og molekylære enheder med forskellige funktionelle grupper vil forbedre drug effektivitet og reducere forbundet bivirkninger1,2. Derudover udnytter nanopartikel systemer hovedsagelig passive og aktive målretning til at nå målet tumorer3.
Passiv målretning udnytter de medfødte egenskaber af nanopartikler og øget permeabilitet og opbevaring (EPR) effekter at nå tumorceller. Kationiske Liposomer har held været anvendt til at levere forskellige anticancermedicin til tumorer i kliniske anvendelser4,5,6. Trods den potentielle effektive kræft terapeutiske effekt, en lav drug koncentration i regionen tumor og manglende evne til at skelne mellem tumorceller fra normalt væv er to store begrænsninger i passiv-targeting nanopartikler7.
Aktive målretning strategier drage fordel af antigen-antistof, ligand-receptor og andre Molekylær anerkendelse interaktioner specifikt levere lægemidler til tumorer8. Glykosaminoglykan placenta Chondroitinsulfat en (plCSA) udtrykkes bredt på de fleste kræftceller og placenta trophoblasts. Derudover malaria proteinet VAR2CSA kan specifikt binder til plCSA9,10. Derfor kan VAR2CSA være et redskab til at målrette menneskelige kræftceller. Men når VAR2CSA er konjugeret med nanopartikler, fuldlængde protein kan begrænse indtrængen af nanopartikler i tumorceller. For nylig opdagede vi en plCSA bindende peptid (plCSA-BP), afledt af malaria proteinet VAR2CSA. plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler hurtigt bundet til choriocarcinoma celler og signifikant øget doxorubicin (DOX) anticancer aktivitet i vivo11; disse partikler også specifikt bundet til placenta trophoblasts og kunne tjene som et redskab til målrettet levering af lægemidler til moderkagen12.
Lipid-polymer nanopartikler består af en lipid éncellelag shell og en hydrofobe polymere kerne og repræsenterer en ny transportør for drug delivery. Disse nanopartikler kombinere fordelene ved Liposomer og polymere nanocarriers, kontrollerbar nanopartikel størrelse, høj biokompatibilitet, vedvarende drug frigivelse, høj drug lastning effektivitet (LE) og fremragende stabilitet13. I dette arbejde brugte vi en trinvis sonikering metode til at syntetisere lipid-polymer nanopartikler. Denne metode er hurtig, bekvem og egnet til opskalering og har været meget anvendt til at forberede lipid-polymer nanopartikler af vores gruppe11,14 og andre15,16,17,18 .
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochlorid (EDC) er en populær carbodiimide anvendes som en crosslinking agent for de tråddannende biomolekyler indeholdende aminer og carboxylates19. Ud over EDC er N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) den mest almindelige konjugation reagens i overfladen og nanopartikel konjugation reaktioner20,21. NHS kan reducere antallet af side reaktioner og øge stabiliteten og udbytte af ester mellemprodukter22,23.
Her, beskriver vi en protokol for syntese af plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler. Først, trinvis sonikering syntesen af DOX-loaded lipid-polymer nanopartikler (DNPs) er beskrevet. Derefter, en EDC/NHS bioconjugate teknik til at generere plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler er indført. Denne bioconjugate teknik kan også bruges til konjugat andre antistoffer og peptider for nanopartikler. Endelig vil beskrive vi fysisk-kemiske egenskaber og in vitro- analysen bruges til at karakterisere plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler. Vi mener, at disse plCSA-målrettet lipid-polymer nanopartikler kunne udgøre et effektivt system for målrettet levering af lægemidler til de fleste menneskelige kræftformer og målrettet levering af lasterne til moderkagen til behandling af placenta lidelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver en effektiv og reproducerbar metode til syntese af plCSA-BP-konjugeret lipid-polymer nanopartikler. Trinvis sonikering metode at forberede lipid-polymer nanopartikler er hurtig, reproducerbare og adskiller sig fra typiske nanoprecipitation metoder, der involverer varme, vortexing eller fordampning. Derfor reducerer udviklede metoden syntese tid. Derudover er EDC/NHS bioconjugate anvendes i denne protokol et almindeligt anvendte og praktisk teknik til konjugat peptider og antistoffer for nanopartikler…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den nationale nøgle-forskning og udvikling Program i Kina (2016YFC1000402), National Natural Sciences Foundation (81571445 og 81771617) og Natural Science Foundation of Guangdong provins (2016A030313178) til X.F. og Shenzhen Basic Research Fund (JCYJ20170413165233512) til X.F.
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
References
- Davis, M. E., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (9), 771 (2008).
- Nie, S., Xing, Y., Kim, G. J., Simons, J. W. Nanotechnology applications in cancer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 257-288 (2007).
- Jabir, N. R., et al. An overview on the current status of cancer nanomedicines. Current Medical Research and Opinion. 34 (5), 911-921 (2018).
- Pillai, G. Nanomedicines for Cancer Therapy: An Update of FDA Approved and Those under Various Stages of Development. SOJ Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 1 (2), 1-13 (2014).
- Marta, T., Luca, S., Serena, M., Luisa, F., Fabio, C. What is the role of nanotechnology in diagnosis and treatment of metastatic breast cancer? Promising Scenarios for the Near Future. Journal of Nanomaterials. 2016, e5436458 (2016).
- Dasari, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action. European journal of Pharmacology. 740, 364-378 (2014).
- Brigger, I., Dubernet, C., Couvreur, P. Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews. 64, 24-36 (2012).
- Steichen, S. D., Caldorera-Moore, M., Peppas, N. A. A review of current nanoparticle and targeting moieties for the delivery of cancer therapeutics. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 48 (3), 416-427 (2013).
- Salanti, A., et al. Targeting human cancer by a glycosaminoglycan binding malaria protein. Cancer Cell. 28 (4), 500-514 (2015).
- Seiler, R., et al. An Oncofetal Glycosaminoglycan Modification Provides Therapeutic Access to Cisplatin-resistant Bladder Cancer. European Urology. 72 (1), 142-150 (2017).
- Zhang, B., et al. Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment. Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).
- Zhang, B., et al. Placenta-specific drug delivery by trophoblast-targeted nanoparticles in mice. Theranostics. 26 (2), 130-137 (2018).
- Zhang, L., et al. Self-assembled lipid–polymer hybrid nanoparticles: a robust drug delivery platform. ACS Nano. 2 (8), 1696-1702 (2008).
- Zheng, M., et al. Single-step assembly of DOX/ICG loaded lipid-polymer nanoparticles for highly effective chemo-photothermal combination therapy. ACS. 7 (3), 2056-2067 (2013).
- Fang, R. H., Aryal, S., Hu, C. -. M. J., Zhang, L. Quick synthesis of lipid− polymer hybrid nanoparticles with low polydispersity using a single-step sonication method. Langmuir. 26 (22), 16958-16962 (2010).
- Gu, L., et al. Folate-modified, indocyanine green-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for targeted delivery of cisplatin. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 28 (7), 690-702 (2017).
- Mandal, B., Mittal, N. K., Balabathula, P., Thoma, L. A., Wood, G. C. Development and in vitro evaluation of core-shell type lipid-polymer hybrid nanoparticles for the delivery of erlotinib in non-small cell lung cancer. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 81, 162-171 (2016).
- Shi, T., et al. Enhanced legumain-recognition and NIR controlled released of cisplatin-indocyanine nanosphere against gastric carcinoma. European Journal of Pharmacology. 794, 184-192 (2017).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
- Hadjipanayis, C. G., et al. EGFRvIII Antibody-Conjugated Iron Oxide Nanoparticles for Magnetic Resonance Imaging-Guided Convection-Enhanced Delivery and Targeted Therapy of Glioblastoma. Recherche en cancérologie. 70 (15), 6303-6312 (2010).
- Sadhukha, T., Wiedmann, T. S., Panyam, J. Inhalable magnetic nanoparticles for targeted hyperthermia in lung cancer therapy. Biomaterials. 34 (21), 5163-5171 (2013).
- Jennings, M., Nicknish, J. Localization of a site of intermolecular cross-linking in human red blood cell band 3 protein. Journal of Biological Chemistry. 260 (9), 5472-5479 (1985).
- Staros, J. V. N-hydroxysulfosuccinimide active esters: bis(N-hydroxysulfosuccinimide) esters of two dicarboxylic acids are hydrophilic, membrane-impermeant, protein cross-linkers. Biochimie. 21 (17), 3950-3955 (1982).
- Valencia, P. M., et al. Single-step assembly of homogenous lipid− polymeric and lipid− quantum dot nanoparticles enabled by microfluidic rapid mixing. ACS. 4 (3), 1671-1679 (2010).
- Altintas, I., et al. Nanobody-albumin nanoparticles (NANAPs) for the delivery of a multikinase inhibitor 17864 to EGFR overexpressing tumor cells. Journal of Controlled Release. 165 (2), 110-118 (2013).
- Maya, S., et al. Cetuximab conjugated O-carboxymethyl chitosan nanoparticles for targeting EGFR overexpressing cancer cells. Carbohydrate Polymers. 93 (2), 661-669 (2013).
- Deepagan, V. G., et al. In vitro targeted imaging and delivery of camptothecin using cetuximab-conjugated multifunctional PLGA-ZnS nanoparticles. Nanomedicine. 7 (4), 507-519 (2012).
- Totaro, K. A., et al. Systematic investigation of EDC/sNHS-mediated bioconjugation reactions for carboxylated peptide substrates. Bioconjugate Chemistry. 27 (4), 994-1004 (2016).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements. Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).
- Chu, Y., et al. Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).
