합성 및 Placental 콘의 황산 (plCSA)-지질 타겟팅-고분자 나노 입자
Summary
여기, 선물이 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (plCSA-BP)의 합성에 대 한 프로토콜-지질 고분자 나노 입자를 통해 단일 단계 쥡니다 bioconjugate 기법을 활용. 이 입자는 가장 인간의 종양 및 암 및 태 반 장애 치료에 태 반 trophoblasts 치료제의 대상된 배달에 대 한 새로운 도구를 구성 합니다.
Abstract
효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 적극적으로 대상 나노 암 치료 하는 유망한 접근 방식을 제공합니다. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)에 다양 한 암 세포와 태 반 trophoblasts 및 말라리아 단백질 VAR2CSA plCSA 바인딩할 수 있는 구체적으로 표현 된다. 암 세포와 태 반 trophoblasts plCSA 보고 placental chondroitin 황산 염 A 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서 파생 또한 구체적으로 바인딩할 수 있습니다. 따라서, plCSA BP 활용 된 나노 입자는 인간의 암 및 placental trophoblasts 대상된 약물 전달에 대 한 도구로 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 독 소 루비 (plCSA-DNPs); 로드 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 방법 단일 쥡니다 단계 및 bioconjugate 기술 방법에 의하여 이루어져 있다. 또한, plCSA-DNPs, 그들의 물리 화학적 특성 및 태 반 choriocarcinoma (JEG3) 셀에 의해 세포질 통풍 관을 결정 하는 포함 한 특성화를 위한 여러 가지 방법은 설명 합니다.
Introduction
효과적인 암 치료 방법 감소 하 고 최소한의 조직 독성으로 종양을 제거 합니다. 따라서, 선택적 종양을 대상으로 성공적인 치료 방법을 탐구 하는 열쇠입니다. 암 치료를 위한 유망한 기회를 제공 하는 나노 입자 그리고 다른 기능적인 그룹 분자 어셈블리 약물 효능을 강화 하 고 관련된 부작용1,2감소. 또한, 나노 시스템은 주로 수동 및 활성 대상 종양3연결할 대상 사용 합니다.
수동 타겟팅 나노 입자와 향상 된 침투성 및 종양 세포에 도달 하는 보존 (EPR) 효과의 타고 난 특성을 이용 한다. 양이온 리 종양 임상 응용4,,56에 다양 한 항 암 제 약물 전달에 성공적으로 사용 되었습니다. 잠재적인 효과적인 암 치료 효과도 불구 하 고 종양과 정상 조직에서 종양 세포를 구별 하는 무 능력에서 낮은 약물 농도 수동 타겟팅 나노7의 두 가지 주요 제한.
활성 타겟팅 전략 활용 항 원-항 체, 리간드-수용 체와 특히 종양8약물을 전달 하기 위해 다른 분자 인식 상호 작용. glycosaminoglycan placental chondroitin 황산 염 (plCSA)은 대부분 암 세포에 placental trophoblasts 광범위 하 게 표현 된다. 또한, 말라리아 단백질 VAR2CSA 바인딩할 수 있습니다 특히 plCSA9,10. 따라서, VAR2CSA는 인간의 암 세포를 대상으로 하는 도구 수 있습니다. 그러나, VAR2CSA은 나노 입자를 활용 때 전체 단백질 종양 세포에 나노 입자의 침투를 제한할 수 있습니다. 최근에, 우리는 plCSA 바인딩 펩 티 드 (BP plCSA), 말라리아 단백질 VAR2CSA에서에서 파생 된 발견. plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자는 급속 하 게 choriocarcinoma 세포와 크게 증가 독 소 루비 (DOX) 항 암 제 활동 vivo 에서11;에 보 세 이 입자는 또한 특별히 placental trophoblasts에 접착 하 고 태12약물의 타겟된 납품을 위한 도구가 될 수 있을.
지질 고분자 나노 입자는 지질 단층 셸 및 소수 성 고분자 코어의 구성 고 약물 전달에 대 한 새로운 캐리어를 대표 한다. 이러한 나노 리 및 제어할 수 있는 나노 입자 크기, 높은 생체 적합성, 지속적인된 약물 방출, 높은 마약 로드 (르), 효율과 우수한 안정성13등 고분자 nanocarriers의 장점을 결합합니다. 이 작품에서는, 우리는 지질 고분자 나노 입자를 합성 하 단일 단계 쥡니다 메서드를 사용. 이 방법은 빠르고, 편리 하 고 확장에 적합 및 널리 이용 되는 지질 고분자 나노 입자를 준비 우리의 그룹11,14 다른 사람에 의해15,,1617,18 .
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 아민 및 carboxylates19를 포함 하는 생체 변화에 대 한 교차 결합 시키는 대리인으로 사용 하는 인기 있는 carbodiimide 이다. EDC, 뿐만 아니라 N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)은 표면 및 나노 활용 반응20,21에서 가장 일반적인 활용 시 약 이다. 보 건국 측 반응의 수를 줄일 수 및 안정성을 향상 하 고 에스터의 수율 중개자22,23.
여기, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자를 합성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, DOX 로드 지질 고분자 나노 입자 (DNPs)의 단일 단계 쥡니다 합성 설명 되어 있습니다. 그런 다음, plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 생성 하기 위한 EDC/NHS bioconjugate 기술 도입. 이 bioconjugate 기술은 또한 다른 항 체와 펩 티 드 나노 입자를 켤레를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자의 특성을 사용 하는 물리 화학적 속성 및 생체 외에서 분석 결과 설명 합니다. 우리는 이러한 plCSA 대상 지질 고분자 나노 입자 가장 인간의 암과 태 반 장애 치료에 태 반에 페이로드의 대상된 배달 하는 약물의 타겟된 배달에 대 한 효과적인 시스템을 구성 수 있습니다 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에는 plCSA BP 활용 된 지질 고분자 나노 입자를 합성 한 효율적이 고 재현 가능한 방법을 제공 한다. 지질 고분자 나노 입자를 준비 하는 단일 단계 쥡니다 메서드는 재현할 수 빠르고 난방, vortexing, 또는 증발을 포함 하는 일반적인 nanoprecipitation 방법에서 다른. 따라서, 개발된 방법은 크게 합성 시간을 줄일 수 있습니다. 또한,이 프로토콜에 사용 된 EDC/NHS bioconjugate 켤레 펩 티 드 및 나노…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에는 자연 과학 재단의 광둥 성 (2016A030313178), 국가 자연과학 기초 (81571445 및 81771617)와 중국의 개발 프로그램 (2016YFC1000402), 국가 핵심 연구에서 교부 금에 의해 지원 되었다 X.F. 및 X.F.에 심천 기본 연구 기금 (JCYJ20170413165233512)
Materials
| plCSA peptide | Shanghai GL Biochem | 573518 | for peptide synthesis |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical | 10009218 | for nanoparticles synthesis |
| Soybean lecithin | Avanti Polar Lipids | 441601 | for nanoparticles synthesis |
| DSPE-PEG-COOH | Avanti Polar Lipids | 880125 | for nanoparticles synthesis |
| Doxorubicin | JKChemical | 113424 | for nanoparticles synthesis |
| Acetonitrile | Shanghai Lingfeng | 1008621 | for nanoparticles synthesis |
| PLGA | Sigma-Aldrich | 719897 | for nanoparticles synthesis |
| Ultrasonic processor | Sonics | VCX130 | for nanoparticles synthesis |
| Centrifuge filter (MWCO 10 kDa) | Millipore | UFC801024 | for nanoparticles purification |
| centrifuge | Sigma | 3-18KS | for nanoparticles purification |
| 2-[morpholino]ethanesulfonic acid(MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | for peptide conjugation |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 3450 | for peptide conjugation |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 56480 | for peptide conjugation |
| Dialysis bags | Spectrum | 132592T | for nanoparticles purification |
| PBS | Hyclone | SH30028.01 | for cell culture |
| 10 mL centrifuge tubes, polypropylene | Aladdin | S-025 | for nanoparticles synthesis |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430791 | for various applications |
| 0.22 μm sterile syringe filter | Millipore | SLGV033RB | for nanoparticles purification |
| 1 ml syringe, polypropylene | BD | 328421 | for nanoparticles synthesis |
| Malvern Zetasizer | Malvern | Nano ZS | for particle size analyer |
| Phosphotungstic acid | for TEM | ||
| TEM grid | EMCN | BZ10024a | for TEM |
| UV-VIS spectrometer | Leagene | DZ0035 | for TEM |
| Transmission electron microscope |
JEOL | JEM-100CXII | for particle size analyer |
| BCA reagent A | Thermo Fisher Scientific | 23228 | for BCA assay |
| BCA reagent B | Thermo Fisher Scientific | 23224 | for BCA assay |
| 96-Well Plates | Corning | 3599 | for BCA assay |
| Plate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan™ GO | for BCA assay |
| 12-well plates | Corning | 3513 | for cell culture |
| JEG3 cell | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | TCHu195 | Human placenta |
| DMEM/F12 | Hyclone | SH30272.01 | phenol red-free |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10100 | for cell culture |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15070063 | for cell culture |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | CKK53 | for celluar uptake |
| Paraformaldehyde | Shanghai Lingfeng | 1372021 | for celluar uptake |
| DAPI | Sangon Biotech | A606584 | for celluar uptake |
| Mounting medium | Life | P36961 | for celluar uptake |
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