Summary
Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.
Abstract
Gut homing van immune cellen is belangrijk voor de pathogenese van inflammatoire darmziekten (IBD). Integrine-afhankelijke cel adhesie te addressins is een cruciale stap in dit proces en therapeutische strategieën die interfereren met de hechting met succes zijn vastgesteld. Het anti-α4β7 integrine antilichaam, vedolizumab, wordt gebruikt voor de klinische behandeling van ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) en verdere verbindingen zijn waarschijnlijk te volgen.
De bijzonderheden omtrent de hechting en de mechanismen van de actie van de anti-integrine antilichamen zijn nog steeds onduidelijk is in vele opzichten als gevolg van de beperkte beschikbare technieken voor het functioneel onderzoek op dit gebied.
Hier presenteren we een dynamische wrijvingscoëfficiënt assay voor de functionele analyse van menselijke cel adhesie onder stromingscondities en het effect van anti-integrine therapieën in het kader van IBD. Het is gebaseerd op de perfusie van primaire menselijke cellen tot en met addressin beklede ultradunne glas haarvaten met real-time microscopische analyse. De bepaling biedt een scala aan mogelijkheden voor verbeteringen en wijzigingen en potentieel voor mechanistische ontdekkingen en translationeel toepassingen houdt.
Introduction
Cel beweging is een stevig gereglementeerde proces onmisbaar voor de ontwikkeling en de functie van multi-cellulaire organismen, maar is ook betrokken bij de pathogenese van een veelheid aan ziekten1. Onlangs, heeft het homing proces van immuuncellen van de bloedstroom naar de perifere weefsels opgedaan steeds meer aandacht, omdat het bijdraagt tot aanvulling en uitbreiding van pathogene cellen in ontstoken weefsels in via het immuunsysteem veroorzaakte ziekten2 ,3. In het bijzonder is homing aangetoond dat translationeel relevantie in inflammatoire darmziekten (IBD). Het therapeutische anti-α4β7 integrine antilichaam vedolizumab bemoeien met gut homing werkzaamheid is gebleken in grote klinische proeven4,5 en is met succes gebruikt in de klinische praktijk levensechte6,7 , 8. verdere verbindingen zijn waarschijnlijk te volgen9,10. Het therapeutische anti-α4 integrine antilichaam, natalizumab, wordt ook gebruikt voor de behandeling van multiple sclerose (MS)11.
Onze functionele begrip van het homing proces in het algemeen en het werkingsmechanisme van dergelijke therapeutische antistoffen is in het bijzonder echter nog beperkt. Het is reeds lang gevestigd dat homing bestaat uit verschillende stappen waaronder cel binden en rollend met latere cel adhesie leidt tot stevige arrestatie gevolgd door trans endothelial migratie12,13. De bovengenoemde antistoffen neutraliseren verschijnsel op het celoppervlak voorkomen van interactie met addressins op het endotheel van de vaatwand. Dit wordt beschouwd als het belemmeren van de vaste cel adhesie14,15. Nog, we zijn pas net begonnen te begrijpen van de differentiële relevantie van specifieke verschijnsel voor cel homing van afzonderlijke cel deelverzamelingen. Bovendien, de effecten van anti-integrine antilichamen op verschillende cel subsets en dosis-respons-verenigingen zijn grotendeels onbekend leidt tot veel open vragen op het gebied van darm homing en Anti-adhesie therapieën in IBD.
Handige hulpmiddelen moeten dergelijke kwesties worden aangepakt zijn daarom hard nodig. Het effect van anti-integrine antilichamen op integrine-addressin interactie is tot nu toe voornamelijk beoordeeld door beoordeling van bindende werkzaamheid/bindende remming met stroom cytometry of via statische hechting assays16,17 ,18,19,20, dus met een schijnbare vereenvoudiging en afwijking van de fysiologische situatie. We onlangs een dynamische wrijvingscoëfficiënt assay om te bestuderen van integrine-afhankelijke hechting van menselijke cellen om te addressins en de effecten van anti-integrine antilichamen onder schuifspanning2gevestigd. Het beginsel van de techniek is eerder aangetoond met de muis cellen21,22. Hier, het werd aangepast en ontwikkeld om de hierboven genoemde translationeel kwesties worden aangepakt, openen nieuwe mogelijkheden beter begrijpen van de mechanismen van therapie met anti-integrine antilichamen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De studies die zijn beschreven in de volgende secties zijn uitgevoerd volgens de goedkeuring van de ethische commissie van de Friedrich-Alexander Universiteit Erlangen-Nuremberg.
1. bereiding van haarvaten
- Rechthoekige haarvaten verbinden met de rubber slang door het uitrekken van de buis aan de ene kant met kleine schaar en zorgvuldig het invoegen van het capillair (ongeveer 0.5 cm) in de buis. Verbinding tussen capillair en buis met kunststof paraffine film afdichten.
- Jas van het capillair met 20 µL van addressin (recombinant Fc chimera; 5 µg/mL, addressin, bijvoorbeeld MAdCAM-1, in coating buffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) of de juiste isotype control-oplossing met behulp van een precisiepipet p20 (vloeistof zal zelf genieten in het capillair). Vervolgens zegel van de kant die niet is aangesloten op de buis met de plastic paraffine film en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C. Gebruik een capillair gevuld alleen met de coating buffer of met het juiste isotype-besturingselement als negatieve controle.
- Verwijder de plastic paraffine folie van de tip van het capillair, leeg de coating door te laten de vloeibare weken uit het capillair op een papieren handdoek en blok haarvaten gedurende ten minste 1 uur met 20 µL van het blokkeren van de oplossing (1 x PBS met 5% BSA) bij 37 ° C. Het zegel van de open zijde van het capillair met kunststof paraffine film. Verwijder niet de blokkerende oplossing alvorens tot microscopie.
2. cel isolatie, behandeling en voorbereiding voor microscopie
Opmerking: Deze stappen kunnen worden uitgevoerd tijdens de incubatie perioden die nodig zijn voor de capillaire voorbereiding.
- 18 mL vertonen volledig menselijk bloed te verzamelen met een aseptische bloedinzameling instellen vanuit de kubusvormige ader van vrijwilligerswerk van personen (bijvoorbeeld IBD patiënten en/of gezonde controles) na de geïnformeerde schriftelijke toestemming volgens de reglementen van de lokale Ethische Commissie.
Opmerking: Deze stap moet alleen worden uitgevoerd door getrainde en ervaren medisch personeel volgens nationale en/of lokale regelgeving. - Doorvoeren van het bloed in een tube van 50 mL en vul aan tot een volume van 35 mL met 1 x PBS. Vervolgens onderlaag het bloed-PBS mengsel met 10 mL van de kleurovergang medium dichtheid.
- Dichtheid kleurovergang centrifugeren uitvoeren voor 15 min op 800 x g en 24 ° C zonder rem te scheiden van de cellen.
- Verzamel de perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) door aspirating van de witte cellaag recht op de top van de kleurovergang middellange laag dichtheid (duidelijk middenlaag). Pipetteer PBMCs in een tube van verse 50 mL, vul aan tot 50 mL met 1 x PBS en Centrifugeer gedurende 10 min bij 300 x g en 10 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL 1 x PBS vervolgens cel het aantal getallen tellen, bijvoorbeeld met behulp van een Neubauer-cel tellen kamer.
- Optioneel: Om te studeren de hechting van granulocyten de volgende procedure uitvoert. Ga anders verder met stap 2.7 of 2.8.
- Verzamel de granulocyt laag (onderste laag na verloop centrifugeren dichtheid met ook de erythrocyten). Resuspendeer de cellen in 40 mL 1 x PBS. Voeg vervolgens 8 mL van 6% Dextran in 1 x PBS, meng zachtjes en laat cellen sediment gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: De erythrocyten zal zinken naar de bodem van de buis, terwijl de granulocyten in suspensie blijft. - Na 30 min, verzamelen de bovendrijvende substantie, breng kwantitatief over in een tube verse 50 mL en centrifuge voor 6 min bij 300 x g - en 4 ° C. Verwijder het supernatant en de resterende erythrocyten lyse door toevoeging van 5 mL van 0,2% NaCl in ddH2O. Incubate voor 1 min.
- Voeg 5 mL van 1,4% NaCl in ddH2O en incubeer gedurende een minuut. Stoppen van de lysis van de hypotone door toevoegen van 20 mL 1 x PBS en centrifuge voor 6 min bij 300 x g - en 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet cel in 10 mL 1 x PBS. Vervolgens tellen cel nummers met een Neubauer-cel tellen kamer.
- Verzamel de granulocyt laag (onderste laag na verloop centrifugeren dichtheid met ook de erythrocyten). Resuspendeer de cellen in 40 mL 1 x PBS. Voeg vervolgens 8 mL van 6% Dextran in 1 x PBS, meng zachtjes en laat cellen sediment gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Optioneel: Zuiveren om te bestuderen van de hechting van PBMC deelverzamelingen, verschillende soorten cellen of deelverzamelingen (bijvoorbeeld CD4+ en CD8+ T cellen of CD19+ B cellen) met behulp van microbeads volgens protocol van de fabrikant of door fluorescentie-geactiveerd Cell sorting (FACS). Ga anders verder met stap 2.8.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 300 x g en 10 ° C. Verwijder het supernatant en vlekken van cellen met cel bijhouden kleurstof (bv CFSE) volgens instructies van de fabrikant.
- Vervolgens de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x gcentrifugeren en weggeworpen. Resuspendeer in 1 x PBS, bepalen het celaantal en Centrifugeer nogmaals gedurende 10 min bij 300 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet gekleurde cel in de juiste hoeveelheid hechting buffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) om het verkrijgen van een schorsing van 1.5 x 106 cellen/mL. Dan, voeg de juiste hoeveelheid 100 mM MnCl2 te verkrijgen van een eindconcentratie van 1 mM.
Opmerking: Deze cellen zijn nu klaar voor microscopie. - Optioneel: Cellen met cytokines, neutraliserende antilichamen of andere verbindingen behandelen. Anders gaat u verder met stap 3.
- Stap 2.10 weglaten en resuspendeer de pellet gekleurde cel uit stap 2.9 in RPMI medium (met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine) te verkrijgen van een concentratie van 1,5 x 106 cellen/mL.
- Pipetteer 1 mL van deze celsuspensie in zoveel putjes van de plaat van een 48-well als er voorwaarden worden geanalyseerd. Altijd bereid een goed met onbehandelde cellen die moeten worden geperfundeerd door een ongecoate capillair als negatieve controle en een goed met onbehandelde cellen die moeten worden geperfundeerd door middel van een capillaire addressin beklede als positieve controle.
- Voor de behandeling met anti-integrine antilichamen, voeg toe de passende hoeveelheid antilichaam (bijv, 10 µg/mL vedolizumab) aan de celsuspensie. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Voor behandeling met cytokines, voeg toe de passende hoeveelheid recombinante cytokine (bijvoorbeeld 10 ng/mL CXCL10) aan de celsuspensie. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Na incubatie, oogst cellen door cellen die meerdere malen met behulp van een precisiepipet van p1000 resuspending. Pipetteer van cellen in een tube van 2 mL, goed weer afspoelen met 1 mL 1 x PBS en toevoegen aan de tube 2 mL. Het nummer van de cel bepalen.
Opmerking: Incubatie van aanhangend cel populaties (bijvoorbeeld monocyten) wellicht aanvullende maatregelen (bijv., behandeling met trypsine) loskoppelen van de cellen van de plaat.
- Centrifuge cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 10 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van de cel in de juiste hoeveelheid hechting buffer te verkrijgen van een schorsing van 1.5 x 106 cellen/mL. Dan, voeg de juiste hoeveelheid 100 mM MnCl2 te verkrijgen van een eindconcentratie van 1 mM. Als voorbehandeling met chemokines Voeg geen MnCl2 aan de celsuspensie. Deze cellen zijn nu klaar voor microscopie.
Opmerking: De minimale volume dat wordt gebruikt voor de assay is afhankelijk van de pomp en de leidingen gebruikt. In deze studie, met behulp van de peristaltische pomp en de leidingen die zijn opgegeven in de Tabel van materialen, was een minimale volume van 400 µL vereist. Gewenste als die van toepassing zijn (afhankelijk van celtype en rendement), kan de concentratie van de cel in de schorsing voor het meten van hogere hechting in een kortere periode worden verhoogd. - Mogelijke wijziging: concurrerende dynamische wrijvingscoëfficiënt assay
- De bovengenoemde stappen met een andere cel bevolking worden vergeleken met elkaar (bijvoorbeeld, regelgevende en effector T cellen geïsoleerd door magnetische kraal isolatie volgens de instructies van de fabrikant het per stap 2.7).
- Vlek elke bevolking met een verschillende kleurstof (bijvoorbeeld CFSE en FarRed) zoals beschreven in stappen 2.8-2.9 te kunnen onderscheiden van cel populaties tijdens microscopie.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de gekleurde cel pellets in de juiste hoeveelheid hechting buffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) om het verkrijgen van een schorsing van 1.5 x 106 cellen/mL.
- Meng gelijke delen van de schorsingen van de cel (bijvoorbeeld 500 µL van regulatoire T-cellen) en 500 µL van effector T cellen te verkrijgen van een finale gemengd cel concentratie van 1.5 x 106 cellen/mL. Dan, voeg de juiste hoeveelheid 100 mM MnCl2 te verkrijgen van een eindconcentratie van 1 mM. Die onderbrekingen kunnen vervolgens worden gebruikt voor concurrentieanalyse van het proces van hechting door zoogdierlevercellen andere cel populaties door het dezelfde capillair.
3. levende cel Imaging dynamische wrijvingscoëfficiënt
- Inschakelen van de Microscoop en selecteer het gewenste filter of laser om te prikkelen de cel bijhouden van dye(s) (b.v., 488 nm laser voor CFSE), een passende doelstelling (bv 40 X) en een overname modus inschakelen tijd vervallen imaging.
- Verwijder de plastic paraffine-film uit de tip van het capillair en verbinden het capillair met een kort stukje slang (ca. 5 cm lengte) door zich het uitrekken van de buis aan de ene kant met kleine schaar en zorgvuldig te voegen het capillair (ongeveer 0.5 cm) in de buis. Verbinding tussen het capillair en de buis met de plastic paraffine film afdichten.
- Monteren van het capillair op een dienblad fixatie (bijvoorbeeld het deksel van een 6-well-plaat met een rechthoekige uitsparing iets korter is dan de lengte van het capillair) en plaatst de vaste capillair op de houder van de lade van de Microscoop, zodat het capillair in focus en klaar is voor microscopie.
- De rubber slang invoegen met de overeenkomstige inkeping van de peristaltische pomp en plaats het einde niet is gekoppeld aan het capillair in het volgens monsterbuisje met de celsuspensie. De korte buis aan de andere kant van het capillair invoegen in een tube van 15 mL voor het verzamelen van doorstroming.
- Laat de opvulling van de buis met een debiet van 500 µL per minuut totdat de celsuspensie bijna bereikt het capillair. Dan laat de capillaire vulling met een debiet van 100 µL/min.
Opmerking: Een snelle vulling opwaarts van het capillair zorgt voor een regelmatige verdeling van de celsuspensie binnen het capillair. - Wanneer het capillair is gevuld met de celsuspensie, aangepast debiet 10 µL/min.
Opmerking: Deze debiet kunnen variëren, wanneer haarvaten van een verschillende grootte of verschillende peristaltische pompen worden gebruikt. In deze studie was het debiet van 10 µL/min geoptimaliseerd voor de pomp en de haarvaten na te bootsen in vivo bloedstroom. - Time-lapse-opnamen van de cellen bewegen langzaam door het capillair langs de addressin beklede binnenwand iedere 2 s voor een totaal van 3 min.
Opmerking: Intervallen en totale tijd kunnen variëren afhankelijk van het celtype en vraag worden aangepakt. - Scherm voordat het capillair teruggooi, de hele capillair via het oog stuk van de Microscoop om ervoor te zorgen dat de sectie weergegeven bij de video vertegenwoordiger is. Indien nodig, een tweede opname maken.
- Gratis de slang van de pomp en laat de resterende vloeistof terug lopen in de 2 mL-buis, dan haal de capillaire en buizen uit de fixatie lade en gaat u verder met de volgende capillair.
4. evaluatie en cel tellen
- Open de time-lapse opeenvolging met de juiste software en de eerste drie beelden ("begin") en de laatste drie beelden ("End") exporteren als TIFF-bestanden.
- Open de drie "Beginning" beelden in ImageJ, converteren naar 32 bits ('Image | Type | 32-bits ') en afbeeldingen samenvoegen (' afbeelding | Kleur | Samenvoegen van kanalen; de kleuren rood, groen en blauw aan toewijzen de verschillende foto's). Samengestelde afbeelding omzetten in RGB (' afbeelding | Type-RGB') en opslaan als TIFF-bestand. Herhaal met de "End" beelden.
Opmerking: In concurrerende dynamische wrijvingscoëfficiënt testen met cellen gekleurd met verschillende kleuren, eerst de kanalen van de beelden voor het analyseren van de hechting van de verschillende cel populaties afzonderlijk te splitsen. - De witte bloedcellen zichtbaar in de "Begin" en "End" samengestelde tellen en het aantal witte bloedcellen in het "begin" van de witte bloedcellen in het "einde" aftrekken.
Opmerking: Het verschil geeft het aantal nieuw naleven van in het tijdsinterval van 3 min cellen. In de samengestelde afbeelding zijn cellen die verplaatst zichtbaar in de specifieke kleur die werd toegewezen aan het desbetreffende frame omdat ze op een andere plek in het vorige en volgende frame lokaliseren. Voor cellen die aanhanger, de rode, groene en blauwe signalen in de dezelfde plek overlapping naar wit. - Om de resultaten beter te visualiseren, een video van de time-lapse sequenties, bijvoorbeeld met behulp van ImageJ te compileren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methode voorgesteld in dit manuscript doelstellingen proces te simuleren de in vivo menselijke cel adhesie aan de endothelial muur zo dicht mogelijk bij functioneel beoordelen cel adhesie en de rol van storende antilichamen. Daarom zijn uiterst dunne haarvaten bedekt met addressins en geperfundeerd met fluorescently geëtiketteerde menselijke cellen van belang met behulp van een pomp perfusie. Met behulp van levende cellen imaging de hechting van menselijke cellen om de addressins te kan worden waargenomen in real time (Figuur 1).
Deze methode is vooral geschikt voor het ophelderen van de mechanismen van Anti-adhesie therapieën in IBD. Zoals blijkt uit figuur 2A, leidt perfusie van haarvaten bekleed met ICAM-1, MAdCAM-1 en VCAM-1 Isotype Fc chimera met menselijke PBMCs tot duidelijke adhesie, wanneer een van de drie addressins aanwezig is. Hechting op isotype beklede haarvaten is daarentegen minimaal. Remming van integrine-addressin interacties met behulp van neutraliserende antilichamen meestal leidt tot een duidelijke daling van de dynamische wrijvingscoëfficiënt thats afwezig, wanneer isotype controle antilichamen (representatief geïllustreerd in figuur 2B, gebundeld worden toegevoegd kwantitatieve gegevens in figuur 2C).
Evenzo kan de gevolgen van chemokines op integrine-affiniteit modulatie door pre-incubatie met dergelijke peptiden in vitroin dit systeem worden onderzocht. Zoals blijkt uit representatieve gegevens in Figuur 3, behandeling van CD4+ menselijke T cellen met CCL2 of CXCL10 leidt tot verhoogde hechting op MAdCAM-1 ten opzichte van onbehandelde menselijke cellen.
Figuur 1: schematische weergave van de werkstroom. Voorbereiding van addressin gecoat uiterst dunne haarvaten en fluorescently geëtiketteerde menselijke cellen (links) wordt gevolgd door perfusie van cellen via het capillair gebruik een peristaltische pomp (midden) en time-lapse microscopie (rechts). Bewerkt met toestemming van referentie23. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: dynamische wrijvingscoëfficiënt van menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) uit controle donoren aan verschillende addressins. (A) aantal nieuw vasthouden PBMCs te haarvaten bekleed met specifieke addressins, hetzij met Fc Isotype controle (n = 6). (B) representatieve beelden van dynamische wrijvingscoëfficiënt in ICAM-1 gecoat haarvaten geperfundeerd met onbehandelde (NT) PBMCs of cellen geïncubeerd met 10 µg/mL anti-CD18 antistof of 10 µg/mL IgG isotype zeggenschap. Begin: Samengevoegd eerst drie beelden van de 3 min volgorde; Einde: Samengevoegde laatste drie beelden van de 3 min volgorde; daaraan vastzittende cellen worden afgebeeld wit. Rugnummers, alsmede het verschil (dat wil zeggen, nieuw daaraan vastzittende cellen) worden aangegeven. Schaal bar = 100 µm. (C) gevolgen van anti-integrine antilichamen (elk gebruikt bij een concentratie van 10 µg/mL) op de dynamische wrijvingscoëfficiënt. Links: Nummer van nieuw daaraan vastzittende cellen naar de haarvaten bedekt met ICAM-1 en geperfundeerd met onbehandeld, anti-CD18-behandeld of IgG isotype controle behandelde cellen; Midden: Nummer van nieuw daaraan vastzittende cellen naar de haarvaten bedekt met VCAM-1 en geperfundeerd met onbehandeld, natalizumab-behandeld of IgG isotype controle behandelde cellen; Rechts: Nummer van nieuw daaraan vastzittende cellen naar de haarvaten bedekt met MAdCAM-1 en geperfundeerd met onbehandeld, vedolizumab-behandeld of IgG isotype controle behandelde cellen (n = 5-6). Staven geven aan middelen met de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Statistische testen werd uitgevoerd met one-way ANOVA gevolgd door meerdere Newman-Keuls vergelijkingstest (* p < 0.05; ** p < 0,01). Bewerkt met toestemming van referentie23. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Chemokine-gemedieerde dynamische wrijvingscoëfficiënt van menselijke CD4+ T cellen aan MAdCAM-1. Beelden van een vertegenwoordiger van de dynamische wrijvingscoëfficiënt assay in MAdCAM-1-coated haarvaten geperfundeerd met onbehandelde (NT) CD4+ T cellen of cellen geïncubeerd met 10 ng/mL rhCXCL10 of met 100 ng/mL rhCCL2. Begin: Samengevoegd eerst drie beelden van de 3 min volgorde; Einde: Samengevoegde laatste drie beelden van de 3 min volgorde; daaraan vastzittende cellen worden afgebeeld wit. Rugnummers, alsmede het verschil (dat wil zeggen, nieuw daaraan vastzittende cellen) worden aangegeven. Schaal bar = 100 µm. Preincubation met chemokines leidt tot verhoogde dynamische adhesie, vermoedelijk als gevolg van integrine-affiniteit modulatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
SupplementaryVideos: films uit drie minuten beeldsequenties uit MAdCAM-1 gecoat haarvaten geperfundeerd met fluorescently geëtiketteerde PBMCs. (A) capillair geperfundeerd met onbehandelde cellen. (B)-capillair geperfundeerd met cellen met 10 µg/mL vedolizumab behandeld. (C) capillair geperfundeerd met cellen behandeld met 10 µg/mL menselijke IgG isotype controle. Cel stroom van bodem tot bovenkant, nieuw daaraan vastzittende cellen worden aangegeven met witte pijltjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bovenstaande protocol beschrijft een nuttige techniek om te bestuderen van de dynamische wrijvingscoëfficiënt van menselijke immune cellen aan endothelial liganden. Door de variatie van de gecoate liganden, geperfundeerd celtypes of deelverzamelingen, incubatie met aanvullende stimuli of verschillende neutraliserende antilichamen, heeft het bijna onbeperkte toepassingsmogelijkheden. Deze dynamische wrijvingscoëfficiënt gehaltebepalingen kunnen dus nuttig zijn om te antwoorden op beide fundamentele vragen van fundamenteel onderzoek, alsmede translationeel query's die helpen kunnen om te ontwikkelen en optimaliseren van klinische therapie met drugs interfereren met het proces van hechting.
Het nut van de bepaling te onderzoeken van de effecten van klinische therapieën van de Anti-adhesie is onlangs aangetoond. Bovendien Toon verschillende cel populaties uiting van verschillende typen en hoeveelheden verschijnsel consistente niveaus van dynamische hechting op de respectieve addressins, ter ondersteuning van de geldigheid van de test-23.
Over het geheel genomen, de voltooiing van het protocol moet ongeveer 6 uur werk en tussentijdse technische uitdagingen. Zodra de coating van het capillair is begonnen, is een kritiek probleem te vermijden van uitdroging. Dit vereist nauwkeurige afdichting tijdens de incubatie stappen en zorgvuldige omgang van de haarvaten, bij het vervangen van oplossingen. Bovendien, vereist de opening van de perfusie-proces enige voorzichtigheid. Als gevolg van het dode volume van de buis is het niet haalbaar om te vullen de hele slang met de definitieve perfusie-debiet. Aan de andere kant, de stroomsnelheid veranderen na het spoelen van het capillair met hoge snelheid leidt tot het risico van onderbreking van de stroom leidt tot de mogelijkheid van de statische wrijvingscoëfficiënt beperken de geldigheid met betrekking tot de dynamische wrijvingscoëfficiënt. Een tijdige overgang naar het definitieve debiet is daarom essentieel. De definitieve debiet moet worden gekozen afhankelijk van de grootte van het pomp, slangen en capillaire gebruikt. Om na te bootsen van menselijk bloedstroom in hoge endothelial venules als zoveel mogelijk, een volume stroom van 0,1 tot 5 wordt mm/s aanbevolen24,25.
De moeilijkheid van de test kan aanzienlijk verhogen, wanneer de wijzigingen worden toegepast. Bijvoorbeeld, wellicht analyse van specifieke T cel subsets veeleisende polarisatie of zuivering strategieën26. Ook, met inbegrip van de homing stappen van binden, rollen en cel activatie12 in het experiment zal verder verhogen de moeilijkheid, aangezien kan het nodig zijn een combinatie van liganden aan de binnenkant van de haarvaten of de (pre) traktatie jas zijn de geperfundeerd met chemo- of cytokines selectine-afhankelijke rollen en chemokine-geïnduceerde cel activeren en integrine affiniteit modulatie27-celpopulatie. Deze kunnen echter met name interessant vragen voor toekomstig onderzoek, vooral als de gepresenteerde techniek maakt het mogelijk om zo'n een verfijnde interactie van de verschillende moleculen met menselijke cellen en liganden functioneel. Zoals hierboven vermeld, kan concurrerend analyseren dynamische wrijvingscoëfficiënt van verschillende anders gekleurde cel populaties in hetzelfde capillaire een ander niveau van complexiteit toevoegen. Bovendien, het heeft ook aangetoond dat endotheliale cellen kunnen worden gebruikt in fluidic systemen in plaats van recombinante liganden28.
Hoewel er een functionele test, wordt de techniek beperkt door de vermindering van de complexe in-vivo netwerken naar een geselecteerde reeks betrokken moleculen in vitro. Dit betekent dat de effecten van onbekende of onverwachte bijkomende factoren kunnen worden over het hoofd gezien of niet voldoende geacht. Echter, dit is een veelvoorkomend probleem in menselijk onderzoek, omdat ethische overwegingen vaak mechanistische in vivo onderzoeken29 verbieden.
Samen genomen, presenteert dit protocol een functionele test voor de analyse van integrine-afhankelijke dynamische wrijvingscoëfficiënt en anti-integrine therapieën in inflammatoire darmziekten. Terwijl het basisprincipe is vrij rechttoe-rechtaan en niet al te moeilijk om uit te voeren, kunnen worden verfraaid en in verschillende opzichten gewijzigd en heeft de potentie om translationeel vragen met betrekking tot Anti-adhesie therapie in IBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.F.N. heeft gediend als adviseur voor Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda en Boehringer. M.F.N. en S.Z. ontvangen onderzoekssteun van Takeda en Roche.
Acknowledgments
Het onderzoek van CN, IA, MFN- en SZ werd gesteund door het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek (IZKF) en het ELAN-programma van de Universiteit Erlangen-Nuremberg, de anders Kröner-Fresenius-Stiftung, de Fritz-Bender-Stiftung, de Duitse Crohn en Colitis Foundation (DCCV), de klinische onderzoek groep CEDER van het Duits onderzoek Raad (DFG), het programma onderwerp DFG Microbiota, de opkomende Field Initiative en de DFG Collaborative Research centra 643, 796 en 1181.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48-well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0.20 mm x 2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 mL Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02 mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
