Caracterización de microbioma marca Next-Generation 16S rRNA Amplicon ordenando
Summary
Aquí presentamos un protocolo de secuenciación de próxima generación para la secuenciación de rRNA 16S que permite la identificación y caracterización de comunidades microbianas en vectores. Este método implica la extracción de ADN, amplificación y código de barras de muestras mediante PCR, secuenciación en una celda de flujo y bioinformática para que coincida con los datos de la secuencia a la información filogenética.
Abstract
En décadas recientes, enfermedades transmitidas por vectores han resurgido y ampliado en alarmantes índices, causando considerables morbosidad y mortalidad en todo el mundo. Carecen de vacunas eficaces y ampliamente disponibles para la mayoría de estas enfermedades, haciendo necesario el desarrollo de estrategias de mitigación de la enfermedad de nuevo. Para ello, una prometedora vía de control de enfermedades implica orientación el microbioma del vector, la comunidad de microbios que habitan en el vector. El microbioma vector desempeña un papel fundamental en la dinámica de patógeno, y las manipulaciones de la microbioma han llevado vector reducido abundancia o patógeno de transmisión por un puñado de enfermedades transmitidas por vectores. Sin embargo, traducir estos resultados en aplicaciones de control de la enfermedad requiere un conocimiento profundo de la ecología microbiana del vector, históricamente limitada por la escasa tecnología en este campo. El advenimiento de métodos de secuenciación de última generación ha permitido la secuenciación rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Dirigidas a gene del rRNA 16S altamente conservadas ha facilitado las caracterizaciones de los microbios presentes en vectores bajo diferentes condiciones ecológicas y experimentales. Esta técnica consiste en la amplificación del gen 16S rRNA, muestra de código de barras mediante PCR, las muestras de la carga en una celda de flujo para la secuencia, y bioinformática se acerca para que coincida con los datos de la secuencia con información filogenética. Especie o género nivel identificación de un número elevado de repeticiones se logra normalmente a través de este enfoque, así evitar problemas de baja detección, resolución y salida de cultivo tradicional, microscopía y tinciones histológicas técnicas. Por lo tanto, este método es adecuado para la caracterización de vectores de microbios en condiciones diversas pero actualmente no puede proporcionar información sobre la función microbiana, ubicación dentro del vector, o respuesta al tratamiento antibiótico. En general, secuenciación de próxima generación de 16S es una técnica poderosa para la mejor comprensión de la identidad y el papel de los microbios del vector en la dinámica de la enfermedad.
Introduction
El resurgimiento y propagación de enfermedades transmitidas por vectores en las últimas décadas plantean una grave amenaza para la salud humano y fauna mundial. Carecen de vacunas efectivas para la mayoría de estas enfermedades, y control de esfuerzos se ven obstaculizados por la naturaleza biológica compleja de interacciones host vector y vectores. Entender el papel de las interacciones microbianas dentro de un vector en la transmisión del patógeno puede permitir el desarrollo de estrategias novedosas que sortear estos desafíos. En particular, las interacciones entre vector asociado microbios comensales, simbiontes y patógeno, conocido como el microbioma, pueden tener consecuencias importantes para la transmisión de patógeno. Abrumadora evidencia ahora apoya esta afirmación con ejemplos que demuestran un vínculo entre el microbioma del vector y la competencia para enfermedades como la malaria, Zika virus y la enfermedad de Lyme1,2,3. Sin embargo, traducir estos resultados en las estrategias de control de enfermedades requiere un conocimiento mucho más detallado de la estructura, función y origen del vector microbiomes. Identificación y caracterización de la comunidad microbiana del vector bajo diferentes condiciones ecológicas y experimentales constituyen un importante camino a seguir en este campo.
Un procedimiento para la identificación de los habitantes microbianos de un vector del patógeno se facilita utilizando señal de negro-legged occidental, pacificus de Ixodes, una especie de vector del patógeno de la enfermedad de Lyme burgdorferi de Borrelia. Aunque las garrapatas albergan más tipos de patógenos humanos que cualquier otro artrópodo, relativamente poco se conoce sobre la biología y la comunidad ecología de garrapatas microbiomes4. Es evidente que las garrapatas albergan una gran variedad de virus, bacterias, hongos y protozoarios comensales, endosimbionte y residentes microbiana transitoria5,4. Trabajo previo ha demostrado fuertes variaciones de Ixodes microbiomes asociados a la geografía, especie, sexo, etapa de la vida y harina de sangre fuente6,7,8. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a esta variación sigue siendo desconocidos y garantizan que más detalladas investigaciones sobre el origen y el montaje de estas comunidades microbianas. Las garrapatas pueden adquirir microbios a través de la transmisión vertical, en contacto con hosts y captación del ambiente a través de los espiráculos, la boca y el poro anal9. Comprender los factores que forma la formación inicial y desarrollo de la garrapata microbioma, específicamente la contribución relativa de la transmisión vertical y medio ambiente, es importante para la comprensión de los patrones naturales y las variaciones de señal diversidad de microbioma y cómo estas comunidades interactúan durante la transmisión del patógeno, con posibles aplicaciones para el control de la enfermedad o del vector.
Técnicas moleculares de gran alcance, tales como secuenciación de próxima generación, ahora existen para la identificación de las comunidades microbianas y pueden emplearse para caracterizar microbiomes vector bajo diversas condiciones ambientales o experimentales. Antes de la llegada de estos métodos de secuenciación de alto rendimiento, la identificación de los microbios confiado predominante en microscopia y cultura. Mientras que la microscopía es una técnica fácil y rápida, métodos morfológicos para la identificación de microbios son inherentemente subjetivas y grueso y limitada por baja sensibilidad y detección10. Métodos basados en la cultura son ampliamente utilizados para la identificación microbiana y pueden utilizarse para determinar la susceptibilidad de los microbios a drogas tratamientos11. Sin embargo, este método también sufre de baja sensibilidad, como se ha estimado que menos del 2% de microbios ambientales pueden ser cultivado en un laboratorio de ajuste de12. Métodos de tinción histológicas también han sido empleados para detectar y localizar microbios específicos en vectores, permiten investigaciones de diversas distribuciones de taxones dentro de la garrapata y estudiar hipótesis sobre las interacciones microbianas. Sin embargo, previo conocimiento de la identidad microbiana se requiere para la selección de las manchas correspondientes, haciendo este enfoque resultan inadecuadas para la identificación y caracterización microbiana. Además, la coloración histológica es un proceso muy tiempo-intensivo, laborioso y no escala bien para tamaños de muestra grandes. Aproximaciones moleculares tradicionales como Sanger secuenciación se limitan semejantemente en su sensibilidad y la detección de diversas comunidades microbianas.
Secuenciación de próxima generación permite la rápida identificación de los microbios de un gran número de muestras. La presencia de genes marcadores estándar y bases de datos de referencia más permite mayor resolución taxonómica, a menudo al nivel de género o especie. Subunidad pequeña ribosomal RNAs se utilizan con frecuencia para lograr este objetivo, con 16S rRNA es el más común debido a la presencia de regiones conservadas y variables dentro del gen, lo que permite la creación de cebadores universales con amplicones único para cada bacteriano especies13,14. Este informe detalla un procedimiento para la identificación de taxa en el microbioma de la garrapata a través de rRNA 16S que ordena nueva generación. En particular, este protocolo hace hincapié en las etapas de preparación de muestras para la secuencia. Más generalizaron más detalles sobre la secuencia y pasos de Bioinformática se proporcionan, ya que hay una variedad de plataformas de secuenciación y los programas de análisis actualmente disponibles, cada uno con la extensa documentación existente. La viabilidad general de este enfoque de secuenciación de próxima generación se demuestra aplicando a una investigación de la Asamblea de la comunidad microbiana en un vector clave de la enfermedad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generación de secuenciación del 16S rRNA ha convertido en un enfoque estándar para la identificación microbiológica y permitió el estudio de cómo microbiomes vector afectan la transmisión de patógeno. El protocolo descrito aquí detalla el uso de este método para investigar la Asamblea de la comunidad microbiana en I. pacificus, una especie de vector para la enfermedad de Lyme; sin embargo, fácilmente puede ser aplicado para el estudio de otras especies de garrapatas o especies de artrópodos vectores…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por National Science Foundation otorga a A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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