Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis
Summary
Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.
Abstract
De elektrische activiteit van cellen in weefsels door elektrofysiologische technieken kan worden gecontroleerd, maar deze zijn meestal beperkt tot de analyse van afzonderlijke cellen. Aangezien een verhoging van intracellulair calcium (Ca2 +) in het cytosol wordt vaak door de elektrische activiteit veroorzaakt, of in antwoord op een groot aantal andere stimuli, dit proces kan worden gecontroleerd door de beeldvorming van cellen geladen met fluorescerende calcium-gevoelige kleurstoffen. Het is echter moeilijk om het imago van deze reactie in een afzonderlijke celtype binnen hele weefsel, omdat deze kleurstoffen worden overgenomen door alle celtypes in het weefsel. In tegenstelling, genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) kunnen worden uitgedrukt in een afzonderlijke celtype en lichten in antwoord op een verhoging van intracellulaire Ca2 +, dus de beeldvorming van Ca2 + signalering in hele bevolkingen van het toelaat individuele celtypes. Hier, wij het gebruik van de GECIs GCaMP3/6 van toepassing op de muis motorische eindplaat, een tripartiete SYNAPS tussen motorische neuronen, skeletspieren en terminal/perisynaptic cellen van Schwann. We tonen het nut van deze techniek in klassieke ex vivo weefsel preparaten. Met behulp van een optische splitter, voeren wij dual-golflengte beeldvorming van dynamische Ca2 + signalen en een statische label van de motorische eindplaat (NMJ) in een benadering die kan gemakkelijk aangepast worden aan twee cel-specifieke GECI of genetisch gecodeerde spanning controleren indicatoren (GEVI) tegelijk. Tot slot bespreken we de routines gebruikt voor het vastleggen van ruimtelijke kaarten van de intensiteit van de fluorescentie. Samen kunnen deze optische, transgene en analytische technieken worden toegepast om te bestuderen van de biologische activiteit van afzonderlijke cel subpopulaties op de NMJ in een breed scala van contexten.
Introduction
De NMJ, zoals alle synapsen, bestaat uit drie elementen: een presynaptische terminal afgeleid van een neuron, een postsynaptisch neuron/effector cel, en een perisynaptic gliale cel1,2. Terwijl de basisaspecten van synaptische transmissie werden eerst gedemonstreerd op deze synapse3, blijven vele aspecten van dit proces onbekend, gedeeltelijk als gevolg van de expressie van de dezelfde moleculen door de verschillende cellulaire elementen van deze synapsen. Bijvoorbeeld, worden receptoren voor zowel de purine adenine nucleotide ATP en acetylcholine (ACh), die mede door motorische neuronen bij de gewervelde NMJ zijn vrijgegeven, uitgedrukt door spieren, cellen van Schwann en motorische neuronen, dus de interpretatie van een complicerende functioneel effect uitgeoefend door deze stoffen (b.v., zender release of reactie, spier strijdkrachtgeneratie)4. Bovendien, hoewel de tripartiete componenten van de NMJ eenvoudig zijn in vergelijking met, bijvoorbeeld neuronen in het centrale zenuwstelsel die vaak meerdere synaptic ingangen vertonen, of motorische neuronen, spiercellen, of cellen van Schwann in reactie op stimuli op basis verschillen op hun intrinsieke heterogeniteit (bijvoorbeeldembryonale afleiding, vezel subtype, morfologie) is onduidelijk. Om elk van deze kwesties, zou het voordelig voor het gelijktijdig het bijhouden van de reactie van veel cellen binnen één synaptic element, evenals spoor, op hetzelfde moment, een dergelijk antwoord op een van de andere afzonderlijke elementen. Conventionele strategieën door middel van chemische kleurstoffen te meten calcium signalering niet kunnen deze twee doelen, bereiken omdat Bad-toegepast kleurstof in beslag door meerdere celtypen na toepassing aan weefsel genomen wordt, en intracellulair geladen kleurstof kan alleen worden gebruikt om te visualiseren individuele of kleine cohorten van cellen. Hier, met behulp van transgene muizen uiting van GECIs ontworpen voor de meting van de cel-specifieke calcium signalering, samen met specifieke imaging en software tools5, we tonen de eerste van deze twee algemene doelstellingen en bespreken hoe de toevoeging van nieuwe transgene hulpmiddelen zou helpen met het bereiken van de tweede. Deze techniek zal zitten nuttig voor iedereen die geïnteresseerd is in het bijhouden van calcium dynamics of andere cellulaire gebeurtenissen waarneembare signalering via gen gecodeerde optische sensoren in meerdere cel populaties op hetzelfde moment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij bieden hier enkele voorbeelden van het meten van Ca2 + reacties in specifieke cellen in intact neuromusculaire weefsel met behulp van GECI-uiten muizen. Om deze experimenten uitvoeren, is het absoluut noodzakelijk niet te verwonden de phrenic zenuw tijdens de dissectie. Naar image Ca2 + antwoorden in de cellen van Schwann op lage of hoge kracht (dat wil zeggen, 20 X of 60 X), moet het BHC of µ-conotoxin naar Blokverplaatsing gebruiken. Voor de beeldvorming van de spaarstand van Ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) GM103554 en GM110767 aan (T.W.G.) en van het National Center for onderzoeksmiddelen 5P20RR018751 en het National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (voor G.W.H.).
Materials
| Myf5-Cre mice | Jax | #007893 | Drives muscle cell expression as early as E136 |
| Wnt1-Cre mice | Jax | #003829 | Drives expression into all Schwann cells at E13 but not P209 |
| Sox10-Cre mice | Jax | #025807 | Drives Schwann cell expression at older ages |
| Conditional GCaMP3 mice | Jax | #029043 | Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion |
| Conditional GCaMP6f mice | Jax | #024105 | Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one) | Hit2Lead | #5102862 | Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8 |
| Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins |
| Minutien pins (0.1mm diameter) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel |
| Eclipse FN1 upright microscope | Nikon | MBA74100 | Allows staging and observation of specimen |
| Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator | Autom8 | MXMScr | Allows movement of specimen |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | Holds recording and stimulating electrodes |
| Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording |
| Microelectrode low-noise data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1550 | Allows electrophysiological data acquisition |
| Microelectrode data analysis system | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Performs electrophysiological data analysis |
| Square wave stimulator | Grass | S48 | Stimulates nerve to excite muscle |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduces stimulation artifacts |
| Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Impales and records nerve-evoked muscle potentials |
| Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter | Sutter | BF150-117-15 | Lengthened and used for suction electrode |
| Micropipette Puller | Sutter | P-97 | Pulls and prepares recording electrodes |
| 1200×1200 pixel, back-illuminated cMOS camera | Photometrics | Prime 95b | Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging |
| Light Source | Lumencor | Spectra X | Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation |
| Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Provide long working distances for visualization of specimen |
| Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp | Sumita | LS-DWL-N | Provides illumination for brightfield observation |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera |
| Single-band Bandpass Filters (512/25-25 and 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Permits dual band imaging |
| 560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter | Sem Rock | FF560-FDi01-25×36 | Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging |
| Imaging data acquisition system | Nikon | NIS Elements – MQS31000 | Allows imaging data acquisition |
| Wavelength control module | Nikon | MQS41220 | Module for imaging data acqusiition |
| Emission splitter hardware module | Nikon | MQS41410 | Module for imaging data acqusiition |
| Imaging data analysis system | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data |
References
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
- Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
- Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
- Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).
- Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).
- Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
- Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
- Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839 (2018).
- Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
