Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt
Summary
Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.
Abstract
Şu anda kullanılabilir böcek öldürücüler çoğunluğu sinir sistemi hedef ve omurgasız sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar oftentimes zararlı sonuçları henüz sinir sistem etkinliğini bir bireyin kayıt için geçerli yöntem verim pahalı ve zahmetli bir hayvandır. Bu emme üçüncü-biçim larva merkezi sinir sistemi, Drosophila melanogaster, elektrodu hazırlanması neuroactive ajanlar, çeşitli sinir fizyolojik rolü belirleyen fizyolojik etkileri test için uysal bir sistemdir CNS aktivite, hem de genetik mutasyonlar sinirsel işlev etkisi yolları. Bu ex vivo hazırlık böcek nöronal aktivite tekrarlanabilir kayıtları oluşturmak tek orta beceri ve elektrofizyolojik uzmanlık dissekan gerektirir. Çok çeşitli kimyasal modülatörler peptidler, dahil olmak üzere, daha sonra doğrudan çözüm CNS etkinliği üzerindeki etkisini ölçmek için serum fizyolojik ile sinir sisteminde uygulanabilir. Ayrıca, genetik teknolojileri, GAL4/UAS sistemi gibi bağımsız olarak veya belirli iyon kanalları, ışınlayıcılar veya eklem bacaklılar CNS işlevine reseptörleri rolünü belirlemek için farmakolojik ajanlar ile tandem uygulanabilir. Bu bağlamda, burada açıklanan deneyleri böcek ilacı toksikolog, böcek taslakları ve gelişimsel biyologlar D. melanogaster kurulan model organizma olduğu önemli ilgi vardır. Bu protokol bir çeşitlilik bilimsel test etmek için yararlı olan modeli böcek, Drosophila melanogaster, merkezi sinir sistemi electrogenesis ölçümü etkinleştirmek için elektrofizyolojik bir yöntemi açıklamak için hedeftir hipotezler.
Introduction
Bu yaklaşım genel amacı modeli böcek, Drosophila melanogastermerkezi sinir sistemi (MSS) electrogenesis hızlı bir şekilde ölçmek araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem güvenilir, hızlı ve maliyet-etkin fizyolojik ve toksikolojik deneme. gerçekleştirmek için İçin yoğun bir çaba anlamak veya sinir işlevi değiştirmek için uygun sinirsel işlev keşfedilmeyi MSS yaşam ve bu nedenle, kritik fizyolojik yolları için esastır. Eklem bacaklılar CNS içinde sinyal yolları karakterizasyonu ölüm hedef kapalı sonuçları sınırlama ikna etmek için omurgasız sinir işlevi bozabilir böcek öldürücüler çeşitli kimyasal sınıflar keşfi sağlamıştır. Sinir sistemi hedef doku dağıtılan böcek öldürücüler1çoğunluğunun olduğundan böylece, böceklerin sinirsel aktivite ölçmek için böcek toksikoloji ve fizyolojisi alanında önemli ilgi yeteneğidir. Henüz, büyüme böcek sinir sistemine ilişkin temel ve uygulamalı bilgi güncel teknikler emek yoğun ve yüksek bir harcama gerektirir beri fizibilite içinde sınırlı nörofizyolojik gelişmiş teknikler gerektirir devam böcek sinir hücre hatları sınırlıdır ve/veya merkez sinapslarda çoğu Artropodların sınırlı erişim. Şu anda, çoğu böcek sinirsel proteinler karakterizasyonu klonlanmış ve heterologously ifade için sonraki ilaç bulma ve elektrofizyolojik kayıtlar, böcek içe doğrultucu potasyum kanalları2 açıklandığı için hedef gerektirir , böcek ryanodine reseptör3, sivrisinek voltaj duyarlı K+ kanal4ve diğerleri. Kapaklı ifade gereksinimini ve düşük fonksiyonel ifade için potansiyel etkisini azaltmak için Bloomquist ve arkadaşları bir nöronal fenotip ikna etmek amaçlı Spodoptera frugiperda (Sf21) hücreleri için yeni bir yöntem olarak kültürlü böcek ilacı keşif5,6. Bu yöntemleri yeni kimya gelişimi için geçerli bir yaklaşım sağlar, henüz bunlar oftentimes farmakolojik ajanlar, böcek ilacı direnci ve karakterizasyonu mekanizmaları tanımlayan karakterizasyonu için aşılmaz bir darboğaz oluşturur temel fizyolojik esasları. Burada, dövülebilir genetik7,8,9 olan bir modeli böcek gelen elektriksel aktivite kaydı ve bilinen ifade şekillerinin sinirsel sağlar bir ex vivo yöntemi açıklamak sinir, eylem yeni geliştirilen ilaçların modu ve diğer toksikolojik çalışmalar düzeyde direnç mekanizmaları karakterizasyonu etkinleştirmek için kompleksleri10,11,12 .
Meyve sineği, D. melanogaster, böcek sinir sistemleri ya da böcek ilacı etki mekanizmaları tanımlamak için ortak bir model organizma ve toksikolojik13, farmakolojik14 çalışma için uygun model organizma olarak kurulan ,15, nörofizyolojik16ve patofizyolojik17,18,19,20 süreçleri omurgalıların. D.melanogaster üreme yetişkin sahne ulaşmadan önce larva ve pupa aşaması da dahil olmak üzere tam başkalaşım gerçekleştirir holometabolous bir böcek var. Gelişim sürecinde önemli farklı hayat aşamalarında remodeling sinir sistemi uğrar ama larva CNS Bu metodoloji odak noktası olacaktır. Tam olarak gelişmiş larva CNS anatomik olarak erimiş ve tekrarlanan ve hemen hemen aynı neuromeric birimleri21,22bir dizi temsil eden ventral sinir form göğüs ve karın kesimleri ile basittir. Azalan motor sinirler ve kaudal subesophageal gangliyon sonundan itibaren köken innervate BEDEN duvarı kasları ve viseral organların larvalar inerler. Şekil 1 larva Drosophila CNS gross anatomi açıklar.
Drosophila kan – beyin bariyerini (BBB) embriyo sonunda geliştirir ve subperineurial Gliyal hücreler (SPG)21tarafından oluşturulur. SPG hücreleri tüm Drosophila CNS23kapsar bitişik, çok düz, endotel benzeri bir sayfa kurmak için yayılmış çok sayıda filopodia benzeri işlemleri oluşturur. Drosophila BBB CNS21besin ve xenobiotics giriş kontrol ederek sinir microenvironment homeostazı koruma içerir omurgalı BBB benzerlikler vardır. CNS BBB tarafından korunması sentetik uyuşturucu, çoğu peptidler ve potansiyel tanıttı diğer xenobiotics24,25, nüfuz kısıtlar henüz bu de güvenilir sinirsel iletim ve fonksiyonu, için bir önkoşuldur küçük molekül modülatörler potenslerine karakterize oluşan sorunlar. Bu bariyer bozabilir ve merkezi sinapslarda hazır farmakolojik erişim sağlamak için basit bir transeksiyon yöntemini kullanır.
En büyük gücü açıklanan metodolojisi basitlik, tekrarlanabilirlik ve nispeten yüksek üretilen iş kapasitesi bu sisteme doğasında var. Protokoldür nispeten kolay usta, belgili tanımlık tertibat az yer gerektirir ve hangi reaktifler ve sarf malzemeleri için azalır sadece ilk mali giriş gereklidir. Ayrıca, açıklanan yöntemi ev sineği, sinek domestica26. merkezi azalan sinir etkinliklerini kaydetmek için tamamen iyileştirilebilir
Protocol
Representative Results
Discussion
Ayrıntıları ilişkili videoda sağlanan ve metin olması koşuluyla faaliyet ve Spike’ı kaydetmek için önemli adımlar Drosophila CNS ex vivosıklığını deşarj. Kısa ya da birkaç azalan nöronlar çoğaltır arasında büyük farklar neden olur oranı ateş temel azaltacaktır çünkü diseksiyon etkinliği yönteminin en kritik yönü var. Ancak, hakim diseksiyonu tekniği sonra bu tahlil ile toplanan veriler son derece tekrarlanabilir ve disiplinlerden geniş bir yelpazesi için iyileştir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bayan Rui Chen diseksiyon ve Drosophila CNS rakamlar gösterilen görüntüler için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Drosophila melanogaster (strain OR) | Bloomington Drosophila Stock Center | 2376 | |
| Vibration isolation table | Kinetic Systems | 9200 series | |
| Faraday Cage | Kinetic Systems | N/A | |
| Dissecting Microscope on a Boom | Nikon | SMZ800N | Multiple scopes can be used; boom stand is critical |
| AC/DC differential amplifier | ADInstruments | AM3000H | The model 1700 can be used instead of the model 3000 |
| audio monitor | ADInstruments | AM3300 | |
| Hum Bug Noise Eliminator | A-M Systems | 726300 | |
| Data Acquisition System (PowerLab) | ADInstruments | PL3504 | Multiple PowerLab models can be used. |
| Lab Chart Pro Software | ADInstruments | N/A – Online Download | |
| Fiber Optic Lights | Edmund Optics | 89-740 | Different light sources can be used, but fiber optics are the most adaptable |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH715 | Different models are acceptable |
| BNC cables | World Precision Instruments | multiple based on size | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | PG52151-4 | |
| Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-1000 | Also can use Narashige PC-100 |
| Black Wax | Carolina Biological Supply | 974228 | |
| Non-coated insect pins, size #2 | Bioquip | 1208S2 | |
| Fince Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 |
References
- Sparks, T. C., Nauen, R. IRAC: Mode of action classification and insecticide resistance management. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 122-128 (2015).
- Swale, D. R., et al. An insecticide resistance-breaking mosquitocide targeting inward rectifier potassium channels in vectors of Zika virus and malaria. Scientific Reports. 6, 36954 (2016).
- Troczka, B. J., et al. Stable expression and functional characterisation of the diamondback moth ryanodine receptor G4946E variant conferring resistance to diamide insecticides. Scientific Reports. 5, 14680 (2015).
- Bloomquist, J. R., et al. Voltage-sensitive potassium KV2 channels as new targets for insecticides. Biopesticides: State of the Art and Future Opportunities. 1172, 71-81 (2014).
- Jenson, L. J., Bloomquist, J. R. Role of serum and ion channel block on growth and hormonally-induced differentiation of Spodoptera frugiperda (Sf21) insect cells. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 90 (3), 131-139 (2015).
- Jenson, L. J., Sun, B., Bloomquist, J. R. Voltage-sensitive potassium channels expressed after 20-Hydroxyecdysone treatment of a mosquito cell line. Insect Biochemistry and Molecular Biolology. 87, 75-80 (2017).
- Chintapalli, V. R., Wang, J., Dow, J. A. Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics. 39 (6), 715-720 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Luan, Z., Li, H. S. Inwardly rectifying potassium channels in Drosophila. Sheng Li Xue Bao. 64 (5), 515-519 (2012).
- Muenzing, S. E. A., et al. Larvalign: Aligning gene expression patterns from the larval brain of Drosophila melanogaster. Neuroinformatics. 16 (1), 65-80 (2017).
- Sprecher, S. G., Reichert, H., Hartenstein, V. Gene expression patterns in primary neuronal clusters of the Drosophila embryonic brain. Gene Expression Patterns. 7 (5), 584-595 (2007).
- Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), e1006907 (2017).
- Manev, H., Dimitrijevic, N. Drosophila model for in vivo pharmacological analgesia research. European Journal of Pharmacology. 491 (2-3), 207-208 (2004).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
- Hekmat-Scafe, D. S., Lundy, M. Y., Ranga, R., Tanouye, M. A. Mutations in the K+/Cl- cotransporter gene kazachoc (kcc) increase seizure susceptibility in Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (35), 8943-8954 (2006).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Watson, M. R., Lagow, R. D., Xu, K., Zhang, B., Bonini, N. M. A Drosophila model for amyotrophic lateral sclerosis reveals motor neuron damage by human SOD1. Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24972-24981 (2008).
- Rajendra, T. K., et al. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. Journal of Cell Biology. 176 (6), 831-841 (2007).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death and Differentiation. 7 (11), 1075-1080 (2000).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31 (44), 15870-15883 (2011).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Current Drug Metabolism. 9 (9), 901-910 (2008).
- Swale, D. R., Sun, B., Tong, F., Bloomquist, J. R. Neurotoxicity and mode of action of N, N-diethyl-meta-toluamide (DEET). PLoS One. 9 (8), e103713 (2014).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (1), 85 (2006).
- Bloomquist, J. R. Mode of action of atracotoxin at central and peripheral synapses of insects. Invertebrate Neuroscience. 5 (1), 45-50 (2003).
- Bloomquist, J. R., Roush, R. T., ffrench-Constant, R. H. Reduced neuronal sensitivity to dieldrin and picrotoxinin in a cyclodiene-resistant strain of Drosophila melanogaster (Meigen). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 19 (1), 17-25 (1992).
- Mutunga, J. M., et al. Neurotoxicology of bis(n)-tacrines on Blattella germanica and Drosophila melanogaster acetylcholinesterase. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 83 (4), 180-194 (2013).
- Chen, R., Swale, D. R. Inwardly rectifying potassium (Kir) channels represent a critical ion conductance pathway in the nervous systems of insects. Scientific Reports. 8 (1), 1617 (2018).
- Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster. Insects. 8 (1), 2 (2016).
- Swale, D. R., et al. Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi. Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).
- Corbel, V., et al. Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet. BMC Biology. 7, 47 (2009).
