体外3D 球形培养模型小鼠前列腺叶的鉴定、组织学特征及解剖
Summary
基因工程鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。在这里, 我们提出了一个协议, 以识别和解剖小鼠泌尿生殖系统前列腺裂片, 区分他们的组织学, 并分离和培养的原发性前列腺细胞体外作为球体的下游分析。
Abstract
基因工程鼠模型 (GEMMs) 是研究大多数类型的人癌症, 包括前列腺癌 (PCa) 的有效的前临床模型。了解小鼠前列腺的解剖和组织学, 对于有效使用和正确描述这种动物模型是很重要的。小鼠前列腺有四不同的裂片, 各有各自的特点。本文对小鼠前列腺叶的解剖和鉴定方法进行了分析。解剖后, 前列腺细胞可以进一步培养,在体外为机械的理解。由于小鼠前列腺原代细胞在体外培养时往往失去正常的特征, 我们在此概述了一种分离细胞并将其生长为3D 球形培养的方法, 这对保持生理细胞的特征。这些3D 文化可用于分析近生理条件下的细胞形态和行为, 调查在疾病发展和进展过程中所涉及的关键蛋白质和通路的变化水平和定位, 并观察对药物治疗的反应。
Introduction
科学界一直在试图阐明几十年来人类癌症发展的复杂机制。虽然潜在的关键参与者和药物靶点的识别始于患者细胞和组织研究, 但这种发现的转化应用往往需要使用临床前动物模型。自从建立了人类癌症联盟 (MMHCC) 的老鼠模型, 一个试图描述和统一小鼠癌症特征的委员会以来, 利用基因工程小鼠模型 (GEMMs) 来建模人类癌症的模型已经稳步上升。模型为全世界科学家1,2。老鼠模型满足了机械研究的需要, 在临床前研究的大多数类型的癌症, 了解的发展, 进展, 反应治疗和后天抵抗3。
前列腺癌是男性最常见的癌症, 影响超过16万人, 每年4。这种疾病的侵袭性形式每年要求数以万计的生命。然而, 疾病进展的机制仍然是不清楚的。这导致严重缺乏有效的治疗方案的晚期和转移性前列腺癌, 这证明了高死亡率的高级前列腺癌患者4。因此, 研究前列腺癌的临床前模型越来越需要。然而, 由于老鼠和人前列腺之间的内在差异, GEMMs 的前列腺癌的建模直到2004年引入了酒吧港口分类系统, 才获得普及, 其中概述了小鼠的组织病理学变化。前列腺在基因操作, 肿瘤变化的鉴定和他们的关系到癌症进展的阶段在人5。在研究任何前列腺 GEMM 模型时, 必须考虑到小鼠前列腺的一个重要特征, 那就是存在四种截然不同的裂片: 前、侧、腹和背。叶在组织病理学和基因表达模式上存在显著差异6。Probasin 蛋白表达模式可以不同的裂片之间的年轻后青春期小鼠7, 这必须考虑, 因为基于 GEMM 模型主要是设计使用一个 Probasin 的助剂称为 Pb-Cre47。由此产生的空间和时间差异, 在创新表达往往导致差异的肿瘤启动和进展时限, 以及差异的癌症变化之间的裂片。因此, 在研究前列腺 GEMMs 肿瘤的发展时, 必须考虑到这种差异, 而个别的裂片可能需要单独评估以获得可重现的结果。本文的第一部分介绍了解剖小鼠前列腺的正确方法, 识别和分离每个裂片, 并识别出裂片之间的组织学差异。
而肿瘤生长和组织病理学的分析可以为肿瘤的发展提供有价值的见解, 但并没有提供关于分子机制的大量信息。为了研究肿瘤的发展和进展机制, 对肿瘤细胞的体外分析往往是有益的。多年来, 有几种方法涉及这些细胞的文化, 包括悬浮培养, 3D 文化8和最近, 正规2D 文化9。虽然这些方法中的大多数导致细胞存活率和增殖率很好, 但3D 的文化提供了一个最接近生理条件的环境。在基底膜细胞外基质 (ECM) 中生长的3D 或球形培养中, 完全分化的腔内细胞通常具有极低的生存率;然而, 基底和中间细胞 (主要是干细胞) 能够繁殖和产生细胞簇称为球体10。这使得它适合于癌症研究, 因为上皮癌被认为是来源于干细胞 (俗称癌症干细胞)11。本议定书的第二部分描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法。所产生的球体可用于几种下游分析, 包括通过活细胞成像、免疫荧光染色、不同蛋白的 organoid 形态学和行为研究, 以及对化疗反应的研究。治疗。
总体而言, 本协议的目标是通过描述小鼠前列腺的解剖和解剖技术以及球形培养的组织处理和体外分析, 勾勒出在前列腺癌中使用小鼠模型的最佳方法。.
Protocol
Representative Results
Discussion
本文概述了小鼠前列腺的解剖方法和单个裂片的鉴定。还描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法, 用于体外分析。
解剖协议的一个关键步骤是 (1) 从鼠标中采集整个 UGS, 并在解剖显微镜下分离各个器官。前列腺组织非常小, 周围的 UGS 的其余部分;因此, 在获取所有四对裂片完好无损的情况下, 从体腔直接收割器官几乎是不可能的。因此, 重要的是从老鼠身上收获整?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家癌症研究所 R01CA161018 的资助。
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
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