Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle
Summary
Gentechnisch veränderte Mäuse sind nützliche Modelle für die Untersuchung von Prostata-Krebs-Mechanismen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Identifizierung und sezieren Prostate Lappen aus einer Maus Urogenitales System, basierend auf Histologie, zu unterscheiden und zu isolieren und als Sphäroide für nachgelagerte Analysen der primären Prostata-Zellen in Vitro Kultur.
Abstract
Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) dienen als effektive präklinischen Modellen zur Untersuchung von den meisten Arten von menschlichen Krebsarten, einschließlich Prostatakrebs (PCa). Verständnis der Anatomie und Histologie der Maus Prostata ist wichtig für die effiziente Nutzung und richtige Charakterisierung von solchen Tiermodellen. Die Maus-Prostata hat vier verschiedene Paare von Lappen, mit jeweils eigenen Merkmalen. Dieser Artikel beschreibt die richtige Methode der Dissektion und Identifikation der Maus Prostata Lappen für Krankheit-Analyse. Post-Dissektion der Prostata-Zellen weiter kultiviert in Vitro zum mechanistischen Verständnis kann. Seit Maus Prostata Primärzellen neigen dazu, ihre normale Eigenschaften verlieren wenn kultivierte in Vitro, beschreiben wir hier eine Methode für die Zellen zu isolieren und wächst sie als 3D Sphäroid Kulturen, die effektiv für die Erhaltung der physiologischen Eigenschaften der Zellen. Diese 3D Kulturen einsetzbar für Zellmorphologie und Verhalten in der Nähe von physiologischen Bedingungen untersuchen verändert Ebenen und Lokalisierungen der wichtigsten Proteine und Bahnen an der Entwicklung beteiligt und Verlauf der Krankheit zu analysieren und mit Blick auf Antworten auf medikamentöse Behandlungen.
Introduction
Die wissenschaftliche Gemeinschaft hat versucht, die komplexen Mechanismen der menschlichen Krebsentstehung jahrzehntelang aufzuklären. Während Identifizierung von potenziellen Akteure und Drogeziele mit Patienten Zellen und Gewebe-Studien beginnt, erfordert die translatorische Anwendung solcher Befunde oft die Verwendung von präklinischen Tiermodellen. Die Verwendung von gentechnisch veränderten Mäusen Modelle (GEMMs) bis Modell menschlichen Krebsarten ist kontinuierlich gestiegen, seit der Gründung des Maus Modelle der menschlichen Krebserkrankungen Consortium (NCI-MMHCC), ein Ausschuss, der versucht, zu beschreiben und zu vereinheitlichen Eigenschaften von Maus-Krebs Modelle für Wissenschaftler weltweit1,2. Maus-Modelle erfüllen die Notwendigkeit mechanistische Studien in präklinischen Studien für die meisten Krebsarten, für das Verständnis von Entwicklung, Fortschritt, Reaktion auf Behandlungen, und Resistance3erworben.
Prostatakrebs ist die am häufigsten auftretende Krebserkrankung bei Männern, betrifft mehr als 160.000 Männer jedes Jahr4. Aggressivere Formen der Erkrankung Anspruch auf Zehntausende von Leben jedes Jahr. Allerdings ist der Mechanismus des Fortschreitens der Krankheit immer noch schlecht verstanden. Dies führt zu einem gravierenden Mangel an effektiven Behandlungsmöglichkeiten für fortgeschrittenen und metastasierten Prostata-Krebs, wie die hohe Sterblichkeitsrate in fortgeschrittenem Prostatakrebs Patienten4belegt. Daher gibt es ein wachsendes Bedürfnis nach präklinischen Modellen, Prostata-Krebs zu studieren. Allerdings aufgrund der inhärenten Unterschiede zwischen der Maus und der menschlichen Prostata, Modellierung von Prostatakrebs bei GEMMs nicht Popularität gewinnen bis Bar Harbor Klassensystem im Jahr 2004 eingeführt wurde, die histopathologischen in der Maus Veränderungen Prostata auf Genmanipulation, Identifikation von neoplastischen Veränderungen und ihre Beziehung zu Stadien der Krebsentwicklung im Menschen5. Ein wichtiges Merkmal der Maus Prostata, die während des Studiums Prostata GEMM-Modell berücksichtigt werden muss ist das Vorhandensein von vier verschiedene Paare von Lappen: anterior, seitliche, ventral und dorsal. Die Lappen zeigen signifikante Unterschiede in der Histopathologie und Gen Ausdruck Muster6. Probasin Protein Expressionsmuster variiert zwischen Lappen in jungen Post-Pubertät Mäusen7, die da GEMM Cre-basierte Modelle meist sollen berücksichtigt werden müssen, mit einer probasin-basierte Promotor Pb-Cre4-7genannt. Die daraus resultierenden unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Cre Ausdruck oft führen zu Unterschieden im Tumor Initiation und Progression Timelines sowie Unterschiede in neoplastischen Veränderungen zwischen den Lappen. Also, es ist wichtig, um diese Unterschiede zu berücksichtigen, während seines Studiums der Tumorentstehung in der Prostata GEMMs, und die einzelnen Lappen müssen separat bewertet werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Der erste Teil dieses Artikels beschreibt die richtigen Methoden, um eine Maus Prostata zu sezieren, identifizieren und jeder Lappen zu trennen und erkennen die histologischen Unterschiede zwischen den Lappen.
Während die Analyse von Tumorwachstum und Histopathologie wertvolle Einblicke in die Entwicklung von Tumoren bereitstellen kann, bieten sie nicht viele Informationen über molekulare Mechanismen. Um den Mechanismus der Tumorentstehung und Progression zu studieren, ist es oft sinnvoll, die Tumor-Zellen in Vitrozu analysieren. Im Laufe der Jahre, die Kulturen dieser Zellen, einschließlich Suspensionskulturen, 3D Kulturen8 beinhalten verschiedene Methoden vorgeschlagen worden und vor kurzem, regelmäßigen 2D Kulturen9. Während die meisten dieser Methoden gute Zelle überleben und Verbreitung Preise führen, bieten 3D Kulturen eine Umgebung, die physiologischen Bedingungen am nächsten kommt. In 3D oder Sphäroid Kulturen in einer Basalmembran extrazelluläre Matrix (ECM) angebaut haben der luminalen ausdifferenzierten Zellen in der Regel sehr geringe Überlebensrate; die basalen und mittleren Zellen (meist Stammzellen) sind jedoch in der Lage zu propagieren und zellcluster namens Sphäroide10zu produzieren. Dies macht es geeignet für eine Krebs-Studie, da epitheliale Krebsarten werden geglaubt, um aus Stammzellen (im Volksmund bekannt als Krebs-Stammzellen)11stammen. Der zweite Teil dieses Protokolls beschreibt eine Methode für die Kultivierung der Maus Prostatazellen in 3D Kulturen. Die daraus resultierende Sphären können für verschiedene Arten von nachgeschalteten Analysen, einschließlich das Studium der organoide Morphologie und Verhalten von live Cell imaging, Immunfluoreszenz-Färbung für verschiedene Proteine und das Studium der Antworten auf Chemotherapeutika verwendet werden Behandlungen.
Insgesamt ist das Ziel dieses Protokolls, optimale Methoden für die Verwendung von Maus-Modellen bei Prostatakrebs durch die Beschreibung der Anatomie und Dissektion Techniken der Maus Prostata und die Verarbeitung des Gewebes für Sphäroid Kulturen und in-vitro- Analyse zu skizzieren .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier beschreibt die Methoden zur Präparation der Maus Prostata und Identifikation der einzelnen Lappen. Auch beschrieben, ist das Protokoll für die Kultivierung der Maus Prostata-Zellen in einer 3D Kultur für in-vitro- Analyse.
Ein wichtiger Schritt bei der Dissektion-Protokoll ist (1) Ernte die gesamte UGS aus der Maus und trennen die einzelnen Organe unter dem Mikroskop Dissektion. Das Prostatagewebe ist sehr klein und umgeben von den Rest des UGS; So ist es praktisch un…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss vom National Cancer Institute, R01CA161018, LK unterstützt.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
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