זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד
Summary
עכברים מהונדסים גנטית הם מודלים שימושי עבור חוקר סרטן הערמונית מנגנונים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לזהות, לנתח אונות הערמונית ממערכת השתן העכבר, להבדיל אותם בהתבסס על היסטולוגיה, לבודד ושל תרבות את תאי הערמונית הראשית in vitro לקשרי כמו spheroids עבור ניתוחים במורד הזרם.
Abstract
מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) משמשים כמודלים ניסויים פרה-קליניים יעיל על חקירת רוב סוגי סרטן אנושי, כולל סרטן הערמונית (PCa). הבנת אנטומיה, היסטולוגיה של הערמונית עכבר חשוב עבור שימוש יעיל ו נאות אפיון כזה חייתיים. הערמונית עכבר יש ארבעה זוגות ברורים של אונות, כל אחד עם תכונות משלהם. מאמר זה מדגים את השיטה הנכונה של ניתוח וזיהוי של האונות הערמונית עכבר לניתוח במחלה. לנתיחה שלאחר, תאי הערמונית יכולים להיות עוד יותר בתרבית במבחנה על ההבנה מכניסטית. מאז העכבר הערמונית ראשי תאים נוטות לאבד המאפיינים שלהם נורמלי כאשר בתרבית במבחנה, אנו מכינים כאן שיטה לבודד את התאים, גדל אותם כמו תרבויות ספרואיד 3D, אשר נמצא יעיל לשם שמירה על פיזיולוגית המאפיינים של התאים. תרבויות אלה 3D יכול לשמש עבור ניתוח תא מורפולוגיה, רמות ההתנהגות בתנאים ליד-פיזיולוגיים, חוקרת משתנה, הגרסא המקומית של חלבונים מפתח, המעורבים בהתפתחות והתקדמות של מחלה, מסתכל תגובות טיפולים תרופות.
Introduction
הקהילה המדעית מנסה להבהיר את מנגנון מורכב של התפתחות סרטן אנושי במשך עשרות שנים. ואילו זיהוי של שחקני המפתח פוטנציאליים סמים מטרות מתחיל עם החולה תאים, רקמות מחקרים, היישום translational של ממצאים כאלה לעיתים קרובות דורשת את השימוש במודלים ניסויים פרה-קליניים. השימוש של עכברים מהונדסים גנטית מודלים (GEMMs) כדי סרטן אנושיים דגם עלתה בהתמדה מאז הקמת העכבר מודלים של האדם סרטן Consortium (NCI-MMHCC), ועדה אשר ביקשו לתאר ולאחד את מאפייני העכבר סרטן מודלים עבור מדענים ברחבי העולם1,2. העכבר מודלים למלא את הצורך ללימודי מכניסטית במחקרים קליניים של רוב סוגי סרטן, להבנת התפתחות, התקדמות, מענה טיפולי, ונרכשה ההתנגדות3.
סרטן הערמונית הוא הסרטן הנפוצות אצל גברים, להשפיע על גברים מעל 160,000 בכל שנה4. צורות אגרסיבי של המחלה טוענים עשרות אלפי אנשים כל שנה. עם זאת, המנגנון של התקדמות המחלה עדיין ממעטים להבין. התוצאה היא חוסר רציני של אפשרויות טיפול יעיל עבור סרטן הערמונית מתקדם ולא גרורתי, כפי שמעידים אחוזי התמותה הגבוהים חולי סרטן הערמונית מתקדם4. לפיכך, יש צורך הולך וגדל עבור מודלים קליניים ללמוד סרטן הערמונית. עם זאת, בשל ההבדלים הטבועים בין העכבר על הערמונית אנושי, מידול של סרטן הערמונית אצל GEMMs לא לנפוצים בשימוש עד מערכת סיווג ב”באר הארבור הוצג ב-2004, אשר התווה שינויים histopathological העכבר הערמונית על מניפולציה גנטית, זיהוי של שינויים אמצעים, והקשר שלהם בשלבים של התקדמות סרטן בני5. מאפיין חשוב אחד של הערמונית עכבר שיש לקחת בחשבון תוך כדי לימוד כל דגם GEMM הערמונית הוא הנוכחות של ארבעה זוגות ברורים של אונות: קדמי, לרוחב, הגחון ו הגבי. האונות מציגים הבדלים משמעותיים ב- histopathology וג’ין ביטוי דפוס6. חלבון probasin ביטוי דפוס יכול להשתנות בין האונות ב עכברים צעירים שלאחר גיל ההתבגרות7, אשר יש לקחת בחשבון מאז מודלים מבוססי-Cre GEMM מיועדים בעיקר באמצעות promotor מבוסס על probasin שנקרא Pb-Cre47. ההבדלים יכולות וכתוצאה מכך Cre ביטוי לעיתים קרובות להוביל הבדלים בין צירי זמן, החניכה, התקדמות, גידול, כמו גם הבדלים בין אמצעים שינויים בין האונות. לפיכך, חשוב להביא בחשבון הבדלים כאלה תוך כדי לימוד התפתחות גידולים בערמונית GEMMs, האונות נפרדות ייתכן צורך להעריך בנפרד על מנת להשיג תוצאות לשחזור. החלק הראשון של מאמר זה מתאר את השיטות נכונה לנתח בלוטת ערמונית העכבר, לזהות להפריד בין האונה כל ושל לזהות את ההבדלים היסטולוגית בין האונות.
בזמן הניתוח של הגידול, histopathology יכול לספק ערך תובנות להתפתחות הגידול, הם אינם מספקים מידע רב אודות המנגנונים המולקולריים. ללמוד את המנגנון של התפתחות גידולים והתקדמות, הוא לעיתים קרובות שימושי לנתח את תאי הגידול בתוך חוץ גופית. מספר שיטות שהוצעו במהלך השנים המערבות תרביות של תאים אלה, לרבות השעיה תרבויות, תרבויות תלת-ממד8 ובתרבויות לאחרונה, 2D קבוע9. בעוד רוב השיטות האלה כתוצאה בשיעורי ההישרדות והתפשטות תאים טובה, התרבויות 3D לספק סביבה הקרובה ביותר בתנאים פיזיולוגיים. 3D או ספרואיד תרבויות גדל מטריצה חוץ-תאית קרום המרתף (ECM), התאים luminal הבדיל לחלוטין בדרך כלל יש שיעור הישרדות נמוך מאוד; עם זאת, התאים הבזליים וביניים (בעיקר תאי גזע) מסוגלים להפיץ ולייצר אשכולות תא שנקרא spheroids10. דבר זה הופך מתאימים למחקר סרטן מאז סרטן אפיתל הסברה שמקורם בתאי גזע (הידוע בכינויו תאי הגזע הסרטניים)11. החלק השני של פרוטוקול זה מתאר שיטה culturing תאי הערמונית עכבר בתרבויות תלת-ממד. הכדורים וכתוצאה מכך יכול לשמש עבור מספר סוגי ניתוחים במורד הזרם, המחקר של מורפולוגיה תא צורב והתנהגות לתא חי הדמיה, immunofluorescence מכתים חלבונים שונים, כולל המחקר של התגובות כימותרפיות טיפולים.
בסך הכל, המטרה של פרוטוקול זה היא להתוות את שיטות האופטימלי עבור באמצעות העכבר מודלים ב סרטן הערמונית על ידי המתארת את האנטומיה וטכניקות דיסקציה של הערמונית עכבר, העיבוד של הרקמה ספרואיד תרבויות וניתוח במבחנה .
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטות ניתוח הערמונית עכבר וזיהוי של האונות נפרדות. תיאר גם הוא הפרוטוקול עבור culturing בתאי הערמונית עכבר תרבות 3D לניתוח במבחנה .
שלב קריטי בפרוטוקול הקרע הוא (1) לקצור את UGS כולו מתוך העכבר הפרדת האיברים בודדים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. רקמת הערמונית הוא מאוד קטן…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המענק מ מכון הסרטן הלאומי, R01CA161018 לדבר.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Recherche en cancérologie. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. . Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Recherche en cancérologie. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Recherche en cancérologie. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Recherche en cancérologie. 70 (18), 7294-7303 (2010).
