Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura
Summary
Topi geneticamente modificati sono modelli utili per studiare i meccanismi di carcinoma della prostata. Qui presentiamo un protocollo per identificare e sezionare i lobi della prostata da un sistema urogenitale del mouse, differenziarli basato sull’istologia e isolare e coltura primaria di cellule della prostata in vitro come sferoidi per analisi successive.
Abstract
Modelli murini geneticamente (GEMM) fungono da efficace modelli pre-clinici per indagare la maggior parte dei tipi di cancri umani, compreso il carcinoma della prostata (PCa). Comprendere l’anatomia e istologia della prostata del mouse è importante per l’uso efficiente e corretta caratterizzazione di tali modelli animali. La prostata del topo ha distinto quattro paia di lobi, ciascuno con le proprie caratteristiche. Questo articolo viene illustrato il metodo corretto di dissezione e identificazione dei lobi della prostata del mouse per l’analisi di malattia. Post-dissezione, le cellule della prostata possono essere ulteriormente coltivate in vitro per la comprensione meccanicistica. Dal mouse cellule primarie della prostata tendono a perdere le loro caratteristiche normali quando coltivate in vitro, descriviamo qui un metodo per isolare le cellule e loro coltivazione come culture sferoide 3D, che è efficace per preservare la fisiologica caratteristiche delle cellule. Queste culture 3D possono essere utilizzate per analizzare la morfologia delle cellule e comportamento in condizioni di quasi-fisiologiche, indagando alterato livelli e localizzazioni di proteine chiave e pathways coinvolti nello sviluppo e progressione di una malattia e guardando risposte ai trattamenti farmacologici.
Introduction
La comunità scientifica ha cercato di chiarire il meccanismo complesso di sviluppo umano del cancro per decenni. Considerando che l’identificazione di potenziali giocatori chiavi e bersagli farmacologici inizia con le cellule pazienti e gli studi del tessuto, l’applicazione traslazionale di tali risultati spesso richiede l’uso di modelli animali preclinici. L’uso di topi geneticamente ingegnerizzati modelli (GEMM) ai cancri umani modello è sempre aumentata dall’istituzione del Mouse modelli di umano cancri Consorzio (NCI-MMHCC), un comitato che ha cercato di descrivere e unificare caratteristiche del cancro del mouse modelli per gli scienziati in tutto il mondo1,2. Modelli murini di soddisfano l’esigenza degli studi meccanicistici in studi pre-clinici della maggior parte dei tipi di cancro, per comprendere lo sviluppo, la progressione, la risposta ai trattamenti e acquisito resistenza3.
Carcinoma della prostata è il cancro più frequente negli uomini, che interessa oltre 160.000 uomini ogni anno4. Forme aggressive della malattia sostengono decine di migliaia di vite ogni anno. Tuttavia, il meccanismo della progressione di malattia è ancora capito male. Ciò provoca una grave mancanza di opzioni di trattamento efficace per carcinoma della prostata avanzato e metastatico, come testimonia l’elevata mortalità in pazienti di carcinoma della prostata avanzato4. Quindi, c’è un crescente bisogno di modelli pre-clinici per lo studio del carcinoma della prostata. Tuttavia, a causa delle differenze intrinseche tra il mouse e la prostata umana, modellazione di carcinoma della prostata in GEMM non ha guadagnato popolarità fino a quando il sistema di classificazione di Bar Harbor è stato introdotto nel 2004, che ha descritto i cambiamenti istopatologici nel topo prostata su manipolazioni genetiche, identificazione di alterazioni neoplastiche e la loro relazione alle fasi della progressione del cancro in esseri umani5. Una caratteristica importante della prostata del mouse che deve essere preso in considerazione durante lo studio di qualsiasi modello GEMM della prostata è la presenza di quattro coppie distinte di lobi: anteriore, laterale, ventrale e dorsale. I lobi presentano differenze significative in istopatologia e gene expression pattern6. Modello di espressione della proteina probasina può variare tra i lobi di giovani post-pubertà topi7, che deve essere considerato poiché modelli GEMM Cre-basato per lo più sono progettati utilizzando un promotore probasina-based chiamato Pb-Cre47. Le differenze risultanti spaziale e temporale di Cre espressione spesso portano a differenze nelle cronologie di iniziazione e progressione del tumore come pure le differenze nei cambiamenti neoplastici fra i lobi. Quindi, è importante tenere conto di tali differenze mentre si studia lo sviluppo del tumore nella prostata GEMM, e i lobi individuali possono devono essere valutati separatamente per ottenere risultati riproducibili. La prima parte di questo articolo descrive i metodi adeguati per sezionare una prostata del topo, identificare e separare ogni lobo e riconoscere le differenze istologiche fra i lobi.
Mentre l’analisi della crescita del tumore e l’istopatologia può fornire informazioni preziose nello sviluppo del tumore, non forniscono molte informazioni su meccanismi molecolari. Per studiare il meccanismo di sviluppo del tumore e la progressione, è spesso utile analizzare le cellule del tumore in vitro. Diversi metodi sono stati suggeriti nel corso degli anni che coinvolgono culture di queste cellule, incluse le colture in sospensione, culture 3D8 e recentemente, regolari 2D culture9. Considerando che la maggior parte di questi metodi si traducono in tassi di sopravvivenza e proliferazione delle cellule buone, le culture 3D forniscono un ambiente che è più vicino a condizioni fisiologiche. In 3D o sferoide colture cresciute in una matrice extracellulare (ECM) di membrana basale, le cellule completamente differenziate luminale hanno solitamente molto basso tasso di sopravvivenza; Tuttavia, le cellule basali e intermedi (principalmente cellule staminali) sono in grado di propagare e produrre aggregati di cellule chiamati sferoidi10. Questo lo rende adatto per uno studio del cancro poiché i cancri epiteliali sono creduti per provenire dalle cellule staminali (popolarmente note come le cellule staminali tumorali)11. La seconda parte del presente protocollo descrive un metodo per la coltura di cellule della prostata del mouse nelle culture 3D. Le sfere risultante possono essere utilizzate per diversi tipi di analisi a valle, tra cui lo studio della morfologia organoid e comportamento da live cell imaging, immunofluorescenza che macchia per diverse proteine e lo studio delle risposte ai chemioterapici trattamenti.
Nel complesso, l’obiettivo del presente protocollo è quello di delineare i metodi ottimali per l’utilizzo di modelli murini nel carcinoma della prostata descrivendo le tecniche di anatomia e dissezione della prostata del mouse e l’elaborazione del tessuto per analisi in vitro e sferoide culture .
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa carta descrive i metodi per la dissezione della prostata del mouse e l’identificazione dei singoli lobi. È anche descritto il protocollo per coltura in una cultura 3D per l’analisi in vitro delle cellule della prostata del mouse.
Un passo fondamentale nel protocollo di dissezione è raccolta l’intera UGS fuori il mouse (1) e separando i singoli organi sotto un microscopio di dissezione. Il tessuto della prostata è molto piccola e circondata dal resto del UGS; così, è pratic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla concessione dal National Cancer Institute, R01CA161018 di LK.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
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