Идентификация, Гистологическая характеристика и рассечение мыши простаты лопастями для в Vitro 3D сфероида культура модели
Summary
Генетически модифицированные мыши являются полезными моделями для изучения механизмов рака простаты. Здесь мы представляем протокол идентификации и вскрыть простаты долей от мыши мочеполовой системы, дифференцировать их по гистологии и изолировать и культуры первичной клетки простаты в vitro как сфероидов течению анализа.
Abstract
Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) служат эффективным доклинических моделей для расследования большинства видов человеческого рака, включая рак простаты (PCa). Понимание анатомии и гистология предстательной железы мыши имеет важное значение для эффективного использования и надлежащего описания таких животных моделей. Простаты мышь имеет четыре различных пар лопастями, каждый с их собственными характеристиками. Эта статья демонстрирует метод надлежащего вскрытия и идентификации мыши простаты лопастями для анализа заболеваний. После вскрытия, клетки простаты может быть далее культивировали в vitro механистического понимания. Начиная с мышь первичной клетки простаты, как правило, теряют их обычных характеристик когда культивировали в пробирке, мы приводим здесь метод для изоляции клеток и рост их как 3D сфероида культуры, который является эффективным для сохранения физиологических характеристики клеток. Эти 3D культуры могут использоваться для анализа морфологии клеток и поведение в рядом физиологических условиях, расследование изменены уровни и локализации основных белков и участвовать в разработке путей и прогрессирование болезни и глядя на Ответы на медикаментозного лечения.
Introduction
Научное сообщество предпринимает попытки прояснить сложный механизм развития человеческого рака на протяжении десятилетий. В то время как выявление потенциальных ключевых игроков и лекарственных препаратов начинается с пациентом клеток и тканей исследования, поступательные применение таких результатов часто требует использования доклинические животных моделей. Использование генной инженерии мышей, модели (GEMMs) модели человеческого рака неуклонно возросла с момента создания консорциума мыши модели из человеческого рака (NCI-MMHCC), Комитет, который попытался описать и унифицировать характеристики мыши рака модели для ученых во всем мире1,2. Удовлетворить потребность в механистической исследования в доклинических исследованиях большинства типов рака, для понимания развития, прогрессии, ответ на лечение и приобрела сопротивление3мыши модели.
Рак предстательной железы является наиболее часто встречающиеся рака у мужчин, затрагивающих более 160 тысяч людей каждый год4. Агрессивные формы болезни утверждают десятки тысяч жизней каждый год. Однако механизм прогрессирования заболевания еще плохо поняты. Это приводит к серьезной нехватки вариантов эффективного лечения для продвинутых и метастазами рака простаты, что подтверждается высокой смертности больных раком простаты4. Следовательно существует растущая потребность в доклинических моделей для изучения рака простаты. Однако вследствие присущего различия между предстательной железы человека и мыши, моделирование рака простаты в GEMMs не набрали популярность до тех пор, пока система классификации Бар Харбор была введена в 2004 году, который изложил гистопатологические изменения мыши простаты генетической манипуляции, идентификация опухолевых изменений и их связь с этапы прогрессирования рака в людей5. Одной важной характеристикой мыши простаты, что должны быть приняты во внимание при изучении любого простаты ГЭММ модели является наличие четырех отдельных пар лопастями: передний, боковой, брюшной и спинной. Долей представляют существенные различия в шаблон6выражение гистопатология и ген. Probasin белок выражению может варьироваться между лопастями в молодых мышей после полового созревания7, которые должны рассматриваться так, как модели на основе Cre ГЭММ предназначены главным образом с помощью probasin на основе promotor называется Pb-Cre47. Результате пространственные и временные различия в Cre выражение часто приводят к различия в сроки инициирования и прогрессии опухоли, а также различия в опухолевые изменения между лопастями. Следовательно важно учитывать такие различия во время учебы развитие опухоли в предстательной железе GEMMs и индивидуальных долей может потребоваться оцениваться отдельно для достижения воспроизводимость результатов. В первой части этой статьи описывает методы вскрыть мыши простаты, идентифицировать и отдельно каждого лепестка, и признать гистологические различия между лопастями.
В то время как анализ роста опухоли и гистопатологии могут предоставить ценную информацию в развитие опухоли, они не предоставляют больше информации о молекулярных механизмов. Чтобы изучить механизм развития опухоли и прогрессии, часто полезно для анализа клеток опухоли в пробирке. С годами, которые включают культур этих клеток, включая подвеска культур, 3D культур8 были предложены несколько методов и недавно, регулярные 2D культур9. В то время как большинство из этих методов приводит к хорошо ячейку выживания и распространения ставок, 3D культур предоставляют среду, которая ближе всего к физиологических условиях. В 3D или сфероида культур, выращенных в базальной мембраны внеклеточного матрикса (ECM) полностью дифференцированной Люминал клетки обычно имеют очень низкой выживаемости; Однако базальную и промежуточные клетки (в основном, стволовые клетки) способны размножаться и производить кластеры клеток называется сфероидов10. Это делает его пригодным для исследования рака, поскольку считается, что эпителиального рака происходят из стволовых клеток, (известный как рак стволовых клеток)11. Второй частью этот протокол описывает метод для культивирования клеток простаты мыши в 3D культур. Результате сферах может использоваться для нескольких типов течению анализов, включая изучение органоид морфологии и поведение живых клеток, изображений, иммунофлюоресценции, пятнать для различных белков и изучение ответов на химиотерапевтическое лечение.
В целом целью настоящего Протокола является наметить оптимальные методы использования мыши модели рака простаты, описывая анатомии и рассечение методы мыши простаты и обработки ткани на сфероиде культур и в пробирке анализа .
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом документе изложены методы для рассечения мыши простаты и идентификации отдельных лепестков. Также описано это протокол для культивирования клеток простаты мыши в 3D культуре для анализа в пробирке .
Важнейшим шагом в протоколе вскрытия-(1) сбор всей ПХГ из мыши…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грант от национального института рака, R01CA161018 в ЛК.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Recherche en cancérologie. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. . Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Recherche en cancérologie. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Recherche en cancérologie. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Recherche en cancérologie. 70 (18), 7294-7303 (2010).
