Identifikation, histologiske karakteristika og dissektion af musen prostata lapper til i Vitro 3D klumpformet kultur modeller
Summary
Gensplejsede mus er nyttige modeller for at undersøge prostatakræft mekanismer. Her præsenterer vi en protokol for at identificere og dissekere prostata lapper fra en mus urogenitale system, differentiere dem baseret på histologi, og isolere og kultur primære prostata celler in vitro- som spheroids for downstream analyser.
Abstract
Gensplejsede musemodeller (GEMMs) fungerer som effektiv prækliniske modeller for at undersøge de fleste typer af menneskelige kræftformer, herunder prostatakræft (PCa). Forståelse af anatomi og histologi af musen prostata er vigtigt for effektiv brug og ordentlig karakterisering af sådanne animal modeller. Musen prostata har fire særskilte par kamre, hver med deres egne karakteristika. Denne artikel viser den korrekte metode til dissektion og identifikation af musen prostata lapper for sygdom analyse. Efter dissektion, prostata celler kan være yderligere kultiveret in vitro- for mekanistisk forståelse. Da musen prostata primærelementer tendens til at miste deres normale egenskaber når kulturperler i vitro, vi skitsere her en metode til at isolere cellerne og voksende dem som 3D klumpformet kulturer, som er effektiv for at bevare den fysiologiske Karakteristik af cellerne. Disse 3D kulturer kan bruges til at analysere celle morfologi og adfærd i nær-fysiologiske tilstande, undersøger ændrede niveauer og lokaliseringer af vigtige proteiner og veje er involveret i udviklingen og progression af en sygdom, og ser på svar til medicinsk behandling.
Introduction
Det videnskabelige samfund har forsøgt at belyse den komplekse mekanisme af udviklingen af menneskelige kræft i årtier. Identifikation af mulige nøgleaktører og narkotika mål begynder med patientens celler og væv undersøgelser, kræver translationel anvendelsen af sådanne resultater ofte brug af prækliniske dyremodeller. Brugen af gensplejsede mus modeller (GEMMs) til model menneskelige kræftformer steget støt siden oprettelsen af mus modeller af menneskelige kræftformer konsortiet (NCI-MMHCC), et udvalg, der søgte at beskrive og forene Karakteristik af musen kræft modeller for forskere over hele verden1,2. Musemodeller opfylde behovet for Mekanistiske undersøgelser i prækliniske studier af de fleste typer af kræft, for at forstå udviklingen, progression, svar på behandlinger, og erhvervet modstand3.
Prostatakræft er den hyppigst forekommende kræftform hos mænd, der berører mere end 160.000 mænd hvert år4. Aggressive former af sygdommen hævder tusindvis af liv hvert år. Men mekanismen af sygdomsprogression er stadig dårligt forstået. Dette resulterer i en alvorlig mangel på effektive behandlingsmuligheder for avancerede og metastatisk prostatakræft, som det fremgår af den høje dødelighed i fremskreden prostatacancer patienter4. Derfor, er der et voksende behov for prækliniske modeller at studere prostatakræft. Men på grund af de iboende forskelle mellem mus og menneskelig prostata, modellering af prostatakræft i GEMMs ikke vinde popularitet indtil Bar Harbor klassificeringssystem, som blev indført i 2004, som skitserede histopatologiske forandringer i mus prostata ved genmanipulation, identifikation af neoplastiske forandringer og deres relation til stadier af kræft progression i mennesker5. En vigtig egenskab ved musen prostata, der skal tages i betragtning samtidig studerer enhver prostata CLAUSS model er tilstedeværelsen af fire særskilte par lapper: anterior, laterale, ventrale og dorsale. Lapper præsentere væsentlige forskelle i histopatologi og gen udtryk mønster6. Probasin protein udtryk mønster kan variere mellem lapper i unge efter puberteten mus7, der må betragtes da Cre-baserede CLAUSS modeller er for det meste konstrueret ved hjælp af en probasin-baseret promotor kaldet Pb-Cre47. De resulterende rumlige og tidsmæssige forskelle i Cre udtryk ofte føre til forskelle i tumor indledningen og progression tidslinjer samt forskelle i neoplastiske forandringer mellem lapper. Derfor er det vigtigt at tage højde for sådanne forskelle samtidig studerer tumor udvikling i prostata GEMMs, og de enkelte kamre kan skal vurderes særskilt for at opnå reproducerbare resultater. Den første del af denne artikel beskriver de rette metoder til at dissekere en mus prostata, identificere og adskille hver lap og anerkender de histologiske forskelle mellem lapper.
Mens analyse af tumorvækst og histopatologi kan give værdifuld indsigt i tumor udvikling, giver de ikke mange oplysninger om molekylære mekanismer. For at studere mekanismen af tumor udvikling og progression, er det ofte nyttigt at analysere tumor celler in vitro. Flere metoder er blevet foreslået i de år, der involverer kulturer af disse celler, herunder suspension kulturer, 3D kulturer8 og for nylig, regelmæssig 2D kulturer9. De fleste af disse metoder medfører god celle overlevelse og spredning satser, skabe 3D kulturer et miljø, der er tættest på fysiologiske tilstande. I 3D eller klumpformet kulturer dyrkes i en basalmembran ekstracellulære matrix (ECM), har fuldt differentierede luminale cellerne normalt meget lav overlevelsesrate; basal og mellemliggende celler (for det meste stamceller) er imidlertid at udbrede og producere celle klynger kaldet spheroids10. Dette gør den velegnet til en kræft undersøgelse, da epitelial kræft menes at stamme fra stamceller (populært kendt som kræftstamceller)11. Den anden del af denne protokol beskriver en metode til dyrkning af musen prostata celler i 3D kulturer. De resulterende kugler kan bruges til flere typer af downstream analyser, herunder undersøgelse af organoid morfologi og adfærd af levende celle imaging, immunofluorescens farvning for forskellige proteiner, og studiet af svar til kemoterapeutiske behandlinger.
Samlet, målet med denne protokol er at skitsere optimale metoder til at bruge musemodeller i prostatakræft ved at beskrive teknikker for anatomi og dissektion af musen prostata og behandling af væv til klumpformet kulturer og in vitro- analyse .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver metoder til dissektion af musen prostata og identifikation af individuelle fliger. Også beskrevet er protokol til dyrkning mus prostata celler i en 3D kultur for in vitro- analyse.
Et kritisk trin i dissektion protokol er (1) høst det hele UGS ud af musen og adskille de enkelte organer under et mikroskop for dissektion. Den prostata væv er meget små og er omgivet af resten af UGS; Det er således næsten umuligt at høste orgel direkte fra kroppen hulrum mens…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute, R01CA161018 til LK.
Materials
| Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit) | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Dissection microscope | |||
| RPMI medium | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| Dissection medium (DMEM + 10%FBS) | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS (Phosphate buffered saline) | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| Collagenase | Thermofisher Scientific | 17018029 | Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| Syringes and Needles | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | Add all componenets, aliquot and store at -20 °C. |
| Matrigel membrane matrix | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II powder | Thermofisher Scientific | 17105041 | Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C |
References
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Recherche en cancérologie. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Society, A. C. . Cancer Facts and Figures. , (2018).
- Shappell, S. B., et al. Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Recherche en cancérologie. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. Expression signature of the mouse prostate. Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).
- Hofner, T., et al. Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin. Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).
- Clarke, M. F., Fuller, M. Stem cells and cancer: two faces of eve. Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Colicino, E. G., et al. Gravin regulates centrosome function through PLK1. Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).
- Ittmann, M., et al. Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee. Recherche en cancérologie. 73 (9), 2718-2736 (2013).
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O. Mouse models of prostate cancer. Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).
- Xiong, X., et al. Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice. Oncogenesis. 1, e26 (2012).
- Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells. Recherche en cancérologie. 70 (18), 7294-7303 (2010).
