Monitoreo de Hippo señalización vía actividad utilizando un Biosensor de luciferasa basado gran Tumor supresor (LATS)
Summary
Aquí presentamos un biosensor basado en luciferase para cuantificar la actividad quinasa de supresor de tumor grande (LATS)-una quinasa central en la vía de señalización de hipopótamo. Este biosensor tiene diversas aplicaciones en investigación básica y traslacional destinada a investigar Hippo vía reguladores en vitro e in vivo.
Abstract
El hipopótamo vía de señalización es un regulador conservado de tamaño del órgano y tiene importantes funciones en la biología del desarrollo y cáncer. Debido a problemas técnicos, sigue siendo difícil evaluar la actividad de esta vía de señalización e interpretar en un contexto biológico. La literatura existente sobre supresor de tumor grande (LATS) se basa en métodos que son cualitativos y no pueden ser escalado-para arriba fácilmente para la detección. Recientemente, hemos desarrollado un biosensor basado en la bioluminiscencia para monitorear la actividad quinasa de componente LATS-a base de la cascada de quinasa de hipopótamo. Aquí, describen los procedimientos para cómo este biosensor letón (Letón-BS) se puede utilizar para caracterizar los reguladores vía de hipopótamo. En primer lugar, proporciona un protocolo detallado para investigar el efecto de un candidato de Proteína sobreexpresada (p. ej., VEGFR2) actividad LATS utilizando el LATS-BS. A continuación, mostramos cómo la LATS-BS se puede utilizar para una pantalla de inhibidor de la cinasa en pequeña escala. Este protocolo viable puede ser escalado-para arriba para realizar pantallas más grandes, que sin duda identificará nuevos reguladores de la vía Hipona.
Introduction
El hipopótamo señalización camino primero fue identificado en Drosophila como un nuevo regulador del crecimiento celular y animal tamaño1,2. Desde su descubrimiento inicial, pruebas de montaje ha demostrado convincentemente que la vía Hipona juega papeles críticos en el desarrollo (p. ej., desarrollo embrionario, control del tamaño del órgano y morfología tridimensional de [3D]), (tumorigénesis por ejemplo, desarrollo de tumores, metástasis, angiogénesis, evasión inmune, inestabilidad genómica, respuesta de estrés y resistencia a los medicamentos) y la homeostasis del tejido (por ejemplo, renovación de células madre y la diferenciación y regeneración de los tejidos después de la lesión) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. señalización de hipopótamo es con frecuencia existen varios tipos de cáncer7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, dilucidar las funciones de la vía Hipona en Biología del cáncer y terapéutica y medicina regenerativa se ha convertido en una de las zonas más calientes en la investigación biomédica.
En síntesis, en el camino de hipopótamo, al activarse por reguladores de arriba (p. ej., contacto célula-célula, nutrimentos y matriz extracelular [MEC]), quinasas de serina/treonina (S/T) MST1/2 (MST; homólogos mamíferos del hipopótamo de Drosophila ) fosforilan o activar adaptador las proteínas hMOB1 y WW45, así como las quinasas LATS1/2 (LATS) que, posteriormente, fosforilan coactivador transcripcional YAP y su paralog TAZ en HX(H/R/K)XX(S/T) conservado (H, histidina; R, arginina; K, lisina; S, serina; T, treonina; X, cualquier aminoácidos) motivos, incluyendo YAP-S127 y TAZ-S8911,12. S127-phosphorylated YAP (YAP-pS127) y S89-phosphorylated TAZ (TAZ-pS89) son degradados por ubiquitinación o se unen a la proteína citoplásmica 14-3-3 y se les impide interactuar con TEAD1-4 factores de transcripción en el núcleo al transactivate aguas abajo genes implicados en la proliferación celular y apoptosis (figura 1). A pesar del enorme interés en el camino de hipopótamo, existen pocas herramientas para medir el hipopótamo señalización y aquellos que se han limitado históricamente a los periodistas de producción transcripcional YAP/TAZ/TEAD. De hecho, hasta hace poco, había no hay herramientas para medir la dinámica y actividad del hipopótamo componentes de señalización de manera cuantitativa en tiempo real, alto rendimiento y no invasiva tanto in vitro como in vivo.
Dada nuestra comprensión del papel de las interacciones de la proteína-proteína en fisiología y patología emergente, hay gran interés en el desarrollo de herramientas que pueden utilizarse para el estudio de estas interacciones en una manera cuantitativa y en tiempo real13, 14,15,16. De hecho, ha habido un progreso significativo en el desarrollo de estrategias de bio-analíticos, incluyendo la levadura dos híbridos (Y2H)17el plasmón superficial (SPR) de resonancia18y Förster Resonancia energética transferencia (traste)19 ensayos, evaluar las interacciones proteína-proteína. Sin embargo, estos enfoques llevan la limitación de requerir significativa optimización de la orientación de reportero, tal que muchas construcciones, deberán analizarse para encontrar una eficiente. Además, estos enfoques también tienen una relativamente baja relación señal a ruido, que puede ser difícil discernir una señalización positiva verdadera.
Ensayos de complementación de proteínas se desarrollaron para superar estas limitaciones. La primera generación de ensayos de complementación de proteínas fue basada en split fluorescencia multicolor proteínas y no podrían solucionar las limitaciones mencionadas20. Las proteínas de la fluorescencia multicolora consisten en solamente un dominio, lo que es difícil de separar en dos fragmentos separados estables con baja afinidad y ruido de fondo21. Posteriormente, la luciferasa de la luciérnaga fue identificado como un nuevo candidato para el uso en el desarrollo de ensayos de complementación de proteínas split. En este enfoque, la luciferasa de la luciérnaga se divide en dos fragmentos (N-terminal y c-terminal luciferase [NLuc y CLuc]) con cada fragmento unida a una proteína diana de interés. Si el NLuc y CLuc se traen en proximidad a la interacción de las proteínas dos blanco, actividad de luciferasa se reconstituye y se genera la luz bioluminiscente en presencia de sustrato luciferin y22de la ATP. En 2001, realizando una proyección combinatoria utilizando una biblioteca que contiene fragmentos de NLuc y CLuc en varios sitios y unido a proteínas con diferentes conectores, Paulmurugan y Gambhir en Universidad de Stanford desarrollaron un split-firefly optimizado sistema de complementación asistida fragmento luciferase de interacciones proteína-proteína23. En este sistema, luciferasa de la luciérnaga se corta de aminoácidos (aa) 398 NLuc y CLuc, que se unen a dos proteínas de interés utilizando a un linker flexible de ocho residuos de glicina y dos residuos de serina.
Utilizando un enfoque similar, recientemente desarrollamos un nuevo LATS-BS fundiendo NLuc a 15 aa de YAP que rodea el sitio de fosforilación de LATS en S127 (YAP15) y CLuc con 14-3-3. La proteína integral de YAP no fue utilizada, para evitar confundir las señales por modificaciones post-traduccionales de YAP (p. ej., fosforilación en otros sitios y ubiquitinación) por otros reguladores de aguas arriba. El LATS-BS presentados aquí no invasiva puede monitorear Hippo actividad de señalización tanto in vitro en células vivas y en vivo en ratones20,24 (figura 2). Aquí, describimos un protocolo detallado para medir LATS kinase actividad en vitro usando el LATS-BS. En primer lugar, mostramos cómo la LATS-BS se puede utilizar para investigar el efecto de una proteína sobreexpresada en la actividad LATS. A continuación, mostramos cómo el biosensor se puede utilizar para supervisar la actividad de la vía Hipona después del tratamiento con los agentes que regulan la vía Hipona. Este protocolo podría utilizarse para identificar y caracterizar la señalización vías o estímulos regulan actividad de quinasa LATS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras que la vía Hipona juega un papel fundamental en diversos procesos biológicos, y la desregulación de la vía Hipona conduce a cáncer6, cómo se regula la vía Hipona en respuesta a varios estímulos no se entiende totalmente. Además, no ha habido ningún sistema cuantitativo y en tiempo real para evaluar la actividad de componentes principales de hipopótamo. Recientemente, hemos desarrollado y había validado un nuevo biosensor para la medición de actividad de la cinasa del letón e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la canadiense Instituto de investigación en salud (CIHR #119325, 148629) y la Fundación Canadiense de cáncer de mama (CBCF) a XY. TA es apoyado por la beca postgrado Vanier Canadá y la beca de postgrado de internacional de Ontario. HJJVR es apoyado por una beca de posgrado Reina Elizabeth II en ciencia y tecnología.
Materials
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 2520056 | 0.25% |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | DMEM with high glucose |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| 5x Passive lysis buffer | Promega | E194A | 30 ml |
| Dual-Glo® Luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 ml kit |
| 20/20 luminometer | Turner Biosystems | 998-2036 | Single tube reader luminometer |
| GloMax®Navigator with dual injectors | Promega | GM2010 | 96-well plates reader luminometer |
References
- Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
- Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94 (2018).
- Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
- van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
- Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
- Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
- Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715 (2011).
- Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
- Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
- Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
- Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
- Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
- Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
- Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
- Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
- Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
- Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
- Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
- Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).
- Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).
