Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria
Summary
Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l’analisi del loro stato metabolico. Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria potrebbe contribuire a caratterizzare meglio la domanda di cellule primarie e potrebbe portare alla medicina più personalizzata.
Abstract
Il requisito metabolico delle cellule tumorali possa influenzare negativamente la sopravvivenza e l’efficacia del trattamento. Al giorno d’oggi, targeting farmaceutici delle vie metaboliche è testato in molti tipi di tumori. Così, la caratterizzazione dell’installazione metabolica delle cellule di cancro è inevitabile al fine di mirare la via corretta per migliorare il risultato complessivo dei pazienti. Purtroppo, nella maggior parte dei cancri, le cellule maligne sono abbastanza difficili da ottenere in numeri più alti e la biopsia del tessuto è richiesta. La leucemia è un’eccezione, dove un numero sufficiente di cellule leucemiche possa essere isolato dal midollo osseo. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l’isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l’analisi successiva del loro stato metabolico mediante Analizzatore di flusso extracellulare. Le cellule leucemiche sono isolate dal gradiente di densità, che non pregiudica la loro sopravvivenza. Il prossimo passo di coltivazione li aiuta a rigenerare, così lo stato metabolico misurato è lo stato delle cellule in condizioni ottimali. Questo protocollo permette di ottenere risultati costanti e ben standardizzati, che potrebbero essere utilizzati per la terapia personalizzata.
Introduction
Il profilo metabolico è una delle caratteristiche principali delle cellule e bioenergetica alterato sono ormai considerati uno dei tratti distintivi di cancro1,2,3. Inoltre, cambiamenti nel setup metabolico potrebbero essere utilizzati nel trattamento di cancro targeting per vie di trasduzione del segnale o macchinario enzimatico di cancro cellule4,5,6. Conoscendo la predisposizione metabolica delle cellule tumorali è così un vantaggio e può contribuire a migliorare la terapia corrente.
Ci sono un sacco di metodi già consolidati che può valutare l’attività metabolica delle cellule in coltura. Per quanto riguarda la glicolisi, l’assorbimento del glucosio può essere misurata mediante la marcatura radioattiva, con 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) o livelli di lattato extracellulare enzimaticamente misurato7,8. Velocità di ossidazione dell’acido grasso è un altro parametro metabolico misurato dal palmitato isotopicamente etichettato9,10. Tasso di consumo di ossigeno è un metodo ampiamente utilizzato per determinare l’attività mitocondriale in cellule11,12, insieme con la membrana mitocondriale potenziale valutazione13,14, ATP/ADP (adenosina 5 ‘-trifosfato di adenosina 5 ‘-difosfato) rapporto misura15 o totale intracellulare ATP misura16. Conosciuta per regolare i processi metabolici di vie di segnalazione potrebbero essere determinata da quantificazioni di proteina e possono migliorare la comprensione delle misure metaboliche17,18,19.
Tuttavia, tutti questi metodi misurano solo uno o, nella migliore delle ipotesi, alcuni parametri metabolici in uno campione contemporaneamente. Misura simultanea del tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) importante, può essere ottenuta per l’analisi di flusso extracellulare da, ad esempio, Seahorse XFp Analyzer. OCR è un indicatore della respirazione mitocondriale ed ECAR è principalmente il risultato della glicolisi (non possiamo ignorare CO2 produzione possibilmente elevare ECAR delle cellule con attività elevata fosforilazione ossidativa)20. Finora, i vari tipi di cellule sono stati studiati utilizzando questi analizzatori21,22,23.
Qui descriviamo il protocollo per l’analisi di flusso extracellulare di primarie blasti (cellule di leucemia derivate dal palco ematopoietica immaturo) da pazienti affetti da leucemia. Al meglio della nostra conoscenza, un protocollo specifico per esplosioni primarie non è ancora disponibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo sopra descritto consente la misurazione dell’attività metabolica valutati dai valori OCR ed ECAR primario blasti leucemici derivate da pazienti con leucemia linfoblastica acuta (tutta) o leucemia mieloide acuta (AML). Il vantaggio di misura utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare è che consente il rilevamento del profilo metabolico in tempo reale in cellule vive. Essenzialmente, ogni passo nel protocollo fornito può essere regolata a seconda del tipo di cella che si intende studiare. Qui, di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i centri di ematologia pediatrica Ceca. Questo lavoro è stato sostenuto dal Grant del Ministero della salute (NV15-28848A), dal Ministero della salute della Repubblica Ceca, University Hospital Motol, Praga, Repubblica Ceca 00064203 e dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e sport NPU I nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
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