Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung der leukämischen Zellen aus dem Knochenmark Leukämie Patienten und Analyse ihrer metabolischen Zustand. Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen könnte dazu beitragen, um die Nachfrage von Primärzellen besser zu charakterisieren und könnte bis zu mehr personalisierte Medizin.
Abstract
Die metabolische Anforderung von Krebszellen kann überleben und die Wirksamkeit der Behandlung negativ beeinflussen. Heutzutage ist die pharmazeutische Ausrichtung der Stoffwechselwege in vielen Arten von Tumoren getestet. Charakterisierung von Krebs Zelle metabolische Setup ist also unumgänglich, um gezielt den richtigen Weg, um das Gesamtergebnis des Patienten zu verbessern. Leider in der Mehrzahl der Krebserkrankungen, die bösartigen Zellen sind ziemlich schwierig, in größerer Zahl zu erhalten und die Gewebeentnahme ist erforderlich. Leukämie ist eine Ausnahme, wo eine ausreichende Anzahl an leukämischen Zellen aus dem Knochenmark isoliert werden. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung der leukämischen Zellen aus dem Knochenmark Leukämie Patienten und anschließende Analyse ihrer metabolischen Zustand mit extrazellulären Flux-Analyzer. Leukämischen Zellen sind durch die Dichtegradienten isoliert, die ihre Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Anbau als nächstes hilft sie zu regenerieren, damit der metabolische Zustand gemessen ist der Zustand der Zellen unter optimalen Bedingungen. Dieses Protokoll ermöglicht konsistente, gut standardisierte Ergebnisse, die für die personalisierte Therapie genutzt werden könnten.
Introduction
Die metabolischen Profils ist eines der Hauptmerkmale von Zellen und veränderten Bioenergetik gelten jetzt als eines der Markenzeichen von Krebs1,2,3. Darüber hinaus könnten Veränderungen im Stoffwechsel-Setup bei der Behandlung von Krebs durch gezielte Transduktion Signalwege oder enzymatische Maschinerie der Krebs Zellen4,5,6verwendet werden. Zu wissen, die metabolische Veranlagung von Krebszellen ist also ein Vorteil und kann helfen, die aktuelle Therapie zu verbessern.
Es gibt eine Fülle von bereits etablierten Methoden, die die Stoffwechselaktivität der Zellen in Kultur beurteilen können. Über Glykolyse, Glukoseaufnahme kann gemessen werden durch die radioaktive Markierung mit 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) oder extrazellulären Laktatwerte gemessen enzymatisch7,8. Fettsäure-Oxidationsrate ist ein anderer metabolischer Parameter gemessen isotopisch beschriftete Palmitat9,10. Sauerstoff-Verbrauch ist eine Methode zur Bestimmung der mitochondrialen Aktivität in den Zellen11,12, zusammen mit der mitochondrialen Membran mögliche Bewertung13,14, ATP/ADP (Adenosin am meisten benutzt 5 ‘-Triphosphat/Adenosin-5′-diphosphat) Verhältnis Messung15 oder insgesamt intrazellulären ATP Messung16. Signalwege, die bekanntermaßen Stoffwechselvorgänge regulieren konnte vom Protein Quantifizierungen festgestellt werden und kann das Verständnis der metabolischen Messungen17,18,19verbessern.
Aber alle diese Methoden messen nur eine oder im besten Fall ein paar metabolische Parametern in einer Probe gleichzeitig. Wichtig ist, kann die gleichzeitige Messung der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) und extrazelluläre Übersäuerung (ECAR) durch die extrazelluläre Flux-Analyse durch, z.B. Seepferdchen XFp Analyzer erreicht werden. OCR ist ein Indikator für die mitochondriale Atmung und ECAR ist vor allem das Ergebnis der Glykolyse (CO2 -Produktion möglicherweise erhebt ECAR Zellen mit hohen Oxidative Phosphorylierung Tätigkeit können wir nicht ignorieren)20. Bisher wurden verschiedene Zelltypen untersucht, mit diesen Analysatoren21,22,23.
Hier beschreiben wir das Protokoll für die extrazelluläre Flussmittel Analyse der primären Blasten (Leukämiezellen abgeleitet aus den unreifen hämatopoetische Phase) von Leukämie-Patienten. Nach bestem Wissen und gewissen ist ein spezielles Protokoll für primäre Blasten noch nicht verfügbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht die Messung der Stoffwechselaktivität von OCR und ECAR Werte in primären leukämischen Blasten abgeleitet von Patienten mit akute lymphoblastische Leukämie (ALL) bewertet oder akute myeloische Leukämie (AML). Der Vorteil der Messung mit einer extrazellulären Flux-Analyzer ist, dass es die Erkennung von metabolischen Profils in Echtzeit in lebenden Zellen ermöglicht. Jeder Schritt in das angegebene Protokoll konnte im wesentlichen je nach Zelltyp angepasst werden, was man …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten den tschechischen Pediatric Hematology Zentren zu danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grant des Gesundheitsministeriums (NV15-28848A), vom Gesundheitsministerium der Tschechischen Republik, University Hospital Motol, Prag, Tschechische Republik 00064203 und vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport NPU ich nr. LO1604.
Materials
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
| Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
| Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
| L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
| HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
| Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
| Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
| Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |
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