シールドとターゲットの遺伝物質と化学キャプシドのアデノ ウイルスを用いた遺伝子導入ベクターの変更を組み合わせる
Summary
ここで説明したプロトコル具体的に単純な化学によって選定されたサイトでアデノ ウイルスのカプシドを変更することも可能。 にします。シールド アデノ ウイルス粒子のベクトルし、ターゲット遺伝子の転送ベクトルを生成することができます、ベクトル ホストの相互作用を学ぶことができます。
Abstract
アデノウイルスベクターは、遺伝的のワクチン接種と腫瘍溶解性 virotherapy の強力なツールです。しかし、彼らは体内納入後特に複数の好ましくないベクトル ホスト相互作用しやすいです。ベクトル表面の定義の変更が実行される場合、望ましくないベクトル ホスト相互作用によって課された制限できるだけコンセンサスを克服します。これらの変更には、不要なやりとりから粒子のシールドと、新しい配位子の導入によってターゲットが含まれます。ここで提示されたプロトコルの目標を生成するリーダーを有効にするのにはシールドし、必要な場合に再ターゲット ヒト アデノ ウイルス遺伝子の転送ベクトルまたは腫瘍溶解性ウイルス。プロトコルは、研究者が合成ポリマー、炭水化物、脂質、または他の生物学的または化学鎖の特定の化学吸着によるアデノ ウイルス ベクター カプシドの表面を変更する有効になります。アデノウイルスベクターの生体内での配信のための障壁の克服と理解を容易にするために示されている結合された遺伝物質と化学キャプシドの変更の最先端の技術を説明します。生物学的活性のウイルスやウイルス由来のベクトルで特定の化学反応を実行するための重要なステップの詳細とコメントの説明が提供されます。プロトコルに記載されている技術 (当然欠席) システインの遺伝子の導入に基づいているアデノ ウィルス由来のベクターの溶媒露出ループに残留。これらのシステイン残基が高価にベクトルの生産後、ベクトルにさまざまな物質のクラスから分子の共有結合化学結合を特定性の効率的な悪用されることができます、特定の化学反応性を提供します。粒子。重要なは、このプロトコルは、さまざまな異なるアデノ ウイルス ベクター カプシドの (非チオール ベースの) の化学修飾を行う簡単に適合できます。最後に、それは可能性が高いそのエンベロープを持たないウイルス遺伝子の転送ベクトル以外、アデノ ウイルスは、このプロトコルの基本から変更できます。
Introduction
アデノ ウイルス (Ad)、アデノ ウイルス、家族のメンバーは、エンベロープを持たない DNA ウイルスの 70 以上の種類の識別 (http://hadvwg.gmu.edu) がこれまでされています。Hemaglutination プロパティ、ゲノム構造および結果を配列する、に応じて 70年広告の種類は 7 種 (人間のアデノ ウィルス A g)1,2に分割できます。ヒトゲノム広告サイズ 38 kb し、正二十面体のヌクレオキャプシド3によってカプセル化されました。その豊富なのためのキャプシド蛋白質ヘクソン、ペントン ベース、および繊維すべてと呼ばれます主要キャプシド蛋白質。最も豊かで、最も大きいキャプシド蛋白質ヘクソンを形作る 20 キャプシドの面があり、それぞれ 12 ヘクソン homotrimers4,5で構成されます。ペントン、正二十面体の辺 (頂点) があるはペントン ベースのポリアクリルアミドゲルから成り、糖繊維スチレンダイマー5,6の組み込まれている頂点スパイク ベースを表します。ネイティブの広告のセルの入力は基本的に 2 つの主要な手順で構成されます。最初に、繊維ノブはプライマリの受容体に結合します。これは、広告の種類は、A、C、E、および F の種から、コクサッキー、アデノ ウイルス受容体 (車) です。この相互作用は、これにより細胞のインテグリンと RGD モチーフのペントンの基本とその結果誘導細胞応答の相互作用を促進する、細胞表面の空間的近接性に virion をもたらします。第二に、細胞骨格の変化は、ウイルス粒子とエンドソーム7への輸送の内面化に します。Virion のリリース、エンドソームの部分的な分解は、時に細胞質に und は最終的にレプリケーションのための核に移動します。
広告をローカルに配信することができますしながら (e.g。、遺伝的のワクチン接種のため)、新規 virotherapy の必要に応じて、血流を介して全身配信いくつかの障壁に直面しています。血流に循環しながら注入された粒子は宿主の免疫系、ウイルスのベクトルの高速中和に至ると広告ベースのベクトルを全身用に非常に非効率的なレンダリングの防衛システムを発生します。さらに、広告の自然 hepatotropism 全身配信と干渉し、広告をその新しい標的細胞にリダイレクトするのには解決する必要があります。
自然免疫系の自然な IgM 抗体を生殖エンコードは急速に認識し、ウイルス粒子8,9の表面に反復性の高い構造をバインドします。これらの免疫の複合体は、ウイルス粒子8の大部分の高速補体を介した中和に至る、補体系の古典と非古典的経路をアクティブにします。広告ウイルス粒子の主要除去 2 番目の経路はマクロファージ10によって媒介され、急性毒性と血行動態の副作用11,12に関連付けられています。広告の場合特に、クッパー細胞、肝臓に存在するのにバインドし、それにより特定スカベン ジャー受容広告ウイルス粒子を介してを取る phagocytically それらを排除し血液13,報14,15 から.特定のスカベン ジャー受容体は、肝類洞内皮細胞 (LSE 細胞)16、識別されているし、LSE 細胞はまた貢献するベクトル除去17がどの程度、まだ説明が必要みたい。さらに、いくつかの広告の種類とその派生の媒介はひと赤血球18 を介して車または補体受容体 CR119結合するによって効率的に隔離します。注記のうち、ひと赤血球とは対照的ようにマウス モデルにおけるこの隔離メカニズムを検討することはできません、マウス赤血球は車を表現しないでください。
または全身用で最初の配信後に広告のいずれかにより、広告に以前感染症への暴露後免疫システムによって生成された特定のアンチ広告抗体を上げる広告ベクトルの有効活用にさらにバリアとで回避する必要があります。効率的に全身配信。
最後に、深刻な広告種類 (Ad5 を含む) の強い hepatotropism は、全身療法で広告のアプリケーションを妨げています。この親和性肝細胞伝達の結果は、血液凝固因子 X (FX) FX 広告ヘクソン タンパク質20,21,22との相互作用によって仲介する広告 virion の親和性の高さによるものです。FX は、ヘパリン硫酸糖鎖 (HSPGs) 肝細胞20,23,24,25面上に virion を橋します。この相互作用のための重要な要因は、他の細胞型の HSPGs とは異なるである肝細胞24HSPGs の N- と O-硫酸化の特定の範囲をするようです。この FX を介した経路に加えて、最近の研究は、さらに経路がまだ肝細胞26,27,28の Ad 変換の結果を識別を示唆します。
最近では、それによって示されている FX は、のみ、広告の肝細胞の情報伝達に関与していないが、virion シールド中性化に対するウイルス粒子のバインディングによっても補完システム26。FX の結合を防止することにより肝細胞伝達の減少したがって、だろう作成広告中和を介して増加の望ましくない副作用生得の免疫組織。
ベクトルおよびホストの有機体間の複雑な相互作用の深遠な知識に全身のアプリケーション ホストの有機体によって課された障害物を回避するためのより効率的なベクトルを開発が必要です。
治療用タンパク質もともと使用されている方法の 1 つは、少なくとも部分的に上記の記述の障壁を克服するために広告のベクトルに適応されています。抗原性と免疫原性治療用タンパク質化合物は、ポリエチレング リコール (PEG)29,30に結合によって削減できた。したがって、ペグなどポリ [n-(2-ヒドロキシプロピル) methacrylamid] ポリマーの共有カップリング (pHPMA) キャプシドに表面シールド不要なベクトル ホスト相互作用からベクトル。一般的に、高分子カップリングはキャプシド表面にランダムに配布される側のリジン残基の ε-アミン グループを対象します。ベクトル粒子溶液、添付のポリマーの親水性の性質のため免疫細胞認識や酵素分解のリスクを低減する安定した水シェルに囲まれています。また、ペグインターフェロン広告ベクトルは反ヘクソン抗体の in vitroとあらかじめ免疫マウス生体内で31で中性化を回避するために示されていた。遺伝キャプシドの変更と対照をなして生産と精製、従来プロデューサー細胞と高価ベクトル株式はまたの生産の使用のためだけではなくを同時にできるように後ポリマーの化学結合が実行されます。カプシドの表面にアミノ酸の何千もの変更。ただし、シールド アミン監督は、全体キャプシドの表面に、高い不均質媒質中の結果、特定の capsomers の変更を許可しない中でランダムに生じる。さらに、有益な効果に必要な大きいポリマー鎖は、ウイルス活性32を損ないます。
これらの制限は、Kreppelらを克服。33は、ベクトル re-とターゲット解除の geneti 化学概念を導入しました。システインは、繊維こんにちループ33、タンパク質 IX34、ヘクソン35,36などの溶媒露出位置ウイルス キャプシドに遺伝子導入されました。ただし、正常細胞の高価でない自然発生する、システインを含む広告ベクトルを生成できます。重要なは、特定の capsomers、1 つの capsomer 内の異なる位置のシステインの挿入チオール グループ反応鎖の非常に特定の変更ことができます。この geneti 化学的アプローチは、広告ベクター デザインで多数の障害を克服するために示されています。Detargeting、こんにちはループが正常に再ターゲットする車欠損細胞33広告ベクトルを変更証明されている繊維ノブにトランスフェリンのチオール系カップリングのアミン系 peg 修飾操作の組み合わせです。ヘクソンは (中和抗体、血液凝固因子 FX) 最も望ましくない相互作用に関与しているので、チオール ベースの変更戦略もヘクソンに適用されました。大規模な PEG 鎖増加肝細胞伝達14,35へと skov 氏 – FX の存在下で細胞を変換する Ad ベクトル粒子を防ぐヘクソンの HVR5 に小さな PEG 鎖を結合します。広告ベクトル粒子の突然変異を運ぶ車の結合を阻害する繊維ノブと FX (と peg 修飾操作位置固有の HVR1 で挿入軸受システイン) の HVR7 抑制結合抗体と補体の中性化を回避するために示されていた感染性を失うことがなくスカベン ジャー受容体を介したの取り込み。興味深いことに、にもかかわらず自然 FX シールドの欠如、peg 修飾操作再び改善肝細胞の伝達ペグのサイズ36の機能として。ただし、共有結合性シールド、細胞内輸送プロセスに影響があるにが示されました。プリルら。pHPMA に基づいており、シールドも共重合体の料金のどちらのモードはセルの入力に影響を与えたが、粒子が核に人身売買に影響を与えるかを実証のための生体機能盾と不可逆的な比較。ベクトルの in vitroとin vivoの37の正荷電の pHPMA 共重合体の粒子が広告の高い伝達効率を維持する核に人身売買の許可のための生体機能のシールドを採用します。
要約すると、これらのデータすべてベクトル ホスト間相互作用が知られているし、見なすことの仮定の下でも、過剰なキャプシド表面改質、全身・ ベクターに関連付けられているハードルを克服するために必要なことを示します。
ここでは、シールドやアデノ ウイルスのベクトル粒子やアデノ ウイルスによる腫瘍溶解性ウイルスの再ターゲットのためのアデノ ウイルスのベクトルのカプシドの部位特異的化学修飾を実行するためのプロトコルを提供します。この技術のコンセプトは、図 1の通りです。それは、合成高分子のキャラクタリゼーション キャプシドの特定の領域の不要なやりとりからシールドができます。同時に、それはまた配位子を接続し、シールドとターゲットを結合するための手段を提供します。単純な化学を使用すると、実験者は共有結合ペプチドやタンパク質、炭水化物、脂質などの分子および他の小さい分子の多種多様なアデノ ウイルスのベクトル表面を変更することができます。さらに、プロトコルは、生物学的整合性と活動の維持の下で生物学的にアクティブなウイルス由来ベクトルの化学修飾の一般的な概念を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
効率で遺伝子導入されたシステインを化学的に変更できますが通常 80-99% と、この効率に影響を与える特定の変数。まず、それは遺伝子導入のシステインに早期酸化が行われていないことが重要です。プロデューサー細胞の還元環境で、セキュリティで保護しながら、ベクトル粒子化学修飾の間に、プロデューサー細胞を解放した後非酸化的環境を提供するためには必須です。このため、濃?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Vector purification and chemical modification | |||
| Argon gas | Air liquide | local gas dealer | |
| Liquid Nitrogen | Air liquide | local gas dealer | |
| 500 mL centrifuge tubes | Corning | 431123 | |
| Stericup Express Plus 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-10g | |
| 2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) | Henke Sass Wolf | 4020.000V0 | |
| Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) | Henke Sass Wolf | 4710009040 | |
| Caesium chloride 99.999% Ultra Quality | Roth | 8627.1 | |
| Silica gel beads | Applichem | A4569.2500 | |
| Methoxypolyethylene glycol maleimide – 750 (PEG mal-750) | Iris Biotech | store in silica gel beads at -80 °C | |
| 13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344059 | only open in hood |
| PD-10 size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 17-0851-01 | store at 4 °C |
| Hepes | AppliChem | A1069.1000 | |
| SDS Ultrapure | AppliChem | A1112,0500 | |
| Glycerol | AppliChem | A1123.1000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for cell-culture | |||
| DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-0231SP | |
| FBS Good | PAN Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAN Biotech | P06-07100 | |
| Biosphere Filter Tips (various sizes) | Sarstedt | ||
| Serological Pipettes (various sizes) | Sarstedt | ||
| reaction tubes (various sizes) | Sarstedt | ||
| TC plates 15cm | Sarstedt | 83.3903 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for silver staining protocol | |||
| Methanol | J.T.Baker | 8045 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | 1613,2500PE | |
| Acetic Acid | AppliChem | A0820,2500PE | |
| Formaldehyde 37% | AppliChem | A0877,0250 | |
| Ethanol absolute | AppliChem | A1613,2500PE | |
| Sodium thiosulfate | AppliChem | 1,418,791,210 | |
| Silver nitrate | AppliChem | A3944.0025 | |
| Sodium carbonate | AppliChem | A3900,0500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Special Lab Equipment | |||
| Desiccator | Nalgene | 5311-0250 | |
| Megafuge 40 | Heraeus | ||
| Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes | Heraeus | ||
| Water bath | Conventional | ||
| Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 | Beckman Coulter | ||
| suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 | Beckman Coulter | ||
| pH -Meter | Conventional | ||
| Stand with clamps | Conventional | ||
| Goose neck lamp | Conventional | ||
| Over-head rotor | Conventional | ||
| Thermal Block | Conventional | ||
| Photometer (OD 260) | Conventional |
References
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