이 프로토콜의 목표 높은 처리량 패션에 애벌레 zebrafish의 용기를 통해 붙일 레이블 음식의 통과 시간을 측정 하는 것입니다.
Zebrafish는 약 안전 테스트에 대 한 대체 모델 생물으로 사용 됩니다. Zebrafish의 위장 (GI)는 포유류의 유전, 신경, 그리고 약리 유사점이 있다. 약물의 임상 테스트 동안 GI 편협 일반적 이며 인간의 건강에 심각한 위협이 있습니다. 전 임상 포유류 모델에서 기 독성에 대 한 테스트 시간, 테스트 화합물, 및 노동 비쌀 수 있다. 여기에 제시 된 높은 처리량 방법 기 안전 문제를 예측 하기 위해 사용할 수 있습니다. 포유류 모델에 비해,이 메서드는 화합물의 낮은 수량을 사용 하는 동안 테스트 기 교통에 복합 효과의 더 편법 평가 대 한 수 있습니다. 이 방법에서는, 애벌레 zebrafish (7 일 게시물 수정) 형광 라벨을 포함 하는 음식을 먹이. 수 유, 후 각 애벌레 물고기는 96-원뿔-하단-잘 접시의 우물에 배치 하 고 테스트 화합물 (물에 녹는) 또는 차량으로 약을 복용. 직감 교통 발생, 대변, 우물의 바닥에 축적 하 고 속도는 이런 우물의 바닥에서 형광을 측정 하 여 모니터링 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 시간 동안 반복적으로. 주어진된 처리 그룹에서 애벌레에서 형광은 평균 하 고 이러한 값은 그래프로 표준 오류 함께 각 측정 시간에 대 한 저조한 식품의 평균 운송 시간이 지남에 나타내는 곡선. 소화 관 통과 시간에 미치는 영향 차량 대우 그룹의 각 치료 그룹에 대 한 곡선 아래의 영역을 비교 하 여 식별 됩니다. 이 방법은 알려진 임상 기 효과; 약물에 의해 유도 된 zebrafish 기 운송 시간에 변화 감지 그것은 하루 기 효과 대 한 치료의 수십이 사용할 수 있습니다. 따라서, 안전한 화합물 수 있습니다 신속 하 게 우선 순위가 포유류 테스트는 신속한 검색과 proffers 3Rs 발전.
Zebrafish (Danio rerio) 척 추가 있는 생물학 모형 및 약물 독성 및 효능; 예측 하는 데 사용 됩니다. 이 분야에서 새로운 응용 프로그램 매년 등장. 포유류 모델 zebrafish의 이점이 그들의 통치, 작은 크기, 그리고 organogenesis 통해 투명도 포함 됩니다. Zebrafish 장기의 기능, 예를 들어, 심장, 눈, 위장 (GI)1,2에 복합 영향 평가로 약물 후보 급성 독성, 또한 예측 하는 데 사용 됩니다. Zebrafish 개발 및 생리학 많은 방법3 에 포유동물의 그들과 유사 하 고 인간의 질병과 관련 된 유전자의 80%는 제 브라 체4.
Zebrafish의 GI로 포유류 기 요로 비슷한 생리학 하지만 더 간단한 건축5. Zebrafish는 아무 위; 이전 장 전구는 식량 창 고 역할을 합니다. 제 브라 내장에서 유전자 발현5포유동물 많은 유사점이 있다. 포유류 처럼, zebrafish의 장의 신경 제어 창 자 운동 성, 그리고 장 innervation 다른 척추 동물6,7의 거울. 이러한 유사점을 바탕으로, 인간의 내장의 기능 장애는 zebrafish, 포유류 모델8에서 파생 하는 방법을 사용 하 여에서 연구 되었습니다.
약물의 임상 테스트 동안 GI 편협 일반적 이며 인간의 건강에 심각한 위협이 있습니다. 2005 년-2010 년 동안 주요 제약 회사에서 프로그램의 검토 공개 임상 연구 종료9의 9%에 대 한 주요 원인으로 기 안전. 전 임상 포유류 모델에서 기 독성에 대 한 테스트 시간, 화합물, 및 노동 비쌀 수 있다. 기 대 중 교통에 대 한 예측 높은 처리량 분석 결과 유연성 테스트, 독성 화합물을 제공 하 고 3Rs 영향을 제공할 수 있습니다. 이러한 분석 결과 제공 하 고 새로운 방법 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 제공 됩니다. 이 높은 처리량 분석 결과 초기 신약 개발 후보, 우선순위 및 더 큰 종에 테스트 기 안전의 감소에 기여에 채택 될 수 있었다.
Zebrafish 애벌레 기 운송 시간, 여기, 측정 하기 위한 새로운 분 광 광도 법 방법은 포유류 기-기능에 대 한 치료 효과 예측할 수 있는 효율적인 분석 결과입니다. 분석 결과 낮은 감도, 그것은 첫 번째 계층 분석 실험 수 독성12에 따라 후보 치료의 껍질 벗기기 위해 적합 높은 긍정적인 predictivity가 있다. 이 방법은 쉽게 실행 하는, 높은 처리량, 있으며 처리 단계 형광 현미경 검사 법 보다 덜 동물을 사용 하 여.
이 방법에 내재 된 기술적 도전이 있다. 형광 음식을 먹이 및 개인 우물에 그들을 전송 하는 것은 처음에 도전 후 개별 애벌레를 잡기. 그러나, 연습, 숙련 된 기술자 15 분 미만에 96 잘 접시를 채울 수 있습니다. 만약 주어진된 시간 지점에서 접시는 실수로 동요와 배설물 문제 읽기 전에 우물의 바닥에서 불안, 축적 감소 표시 됩니다. 이것은 동요 하지 않고 신중 하 게,에서 plate(s)를 이동 하 여 피할 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 정상적인 움직임, 플레이트 분 광 광도 계 자동화 한 서랍을 포함 하 여 분석 결과 방해 하지 않았다. 독자는 히터 장착 플레이트 (즉, 접시 필요가 없습니다 측정 사이 인큐베이터에 반환), 분석 결과 근처 실험실 벤치 장애의 더 낮은 기회에 대 한 최적화 수 있지만 이것은 우리의 경험에서 필요 하 고.
초기 시도 방법에 먹이 일 전에 분석 결과에 포함 되지 않았다. 그 ‘연습’ 수 유 없이 낮은 숫자 애벌레의 치료 응용 프로그램 전에 허용 되는 시간 동안 충분 한 형광 음식 소비. 그 시도에 치료 그룹 내에서 유사 했다, 하 고 더 많은 데이터를 시간이 지남에 낮은/아니오 신호를 축적으로 인해 사용할 수 없게 되었습니다. 심지어 연습 먹이, 일부 애벌레 형광 음식의 충분 한 양을 소모 하지 않는, 그 애벌레에서 데이터 제외 그룹 내에서 변이 감소와 치료 효과 파악 하는 능력을 증가. 큰 그룹 크기 (즉, 24 대 12) 시작 유용한 데이터 분석에 기여 하는 애벌레의 충분 한 숫자에 대 한 수 있습니다.
그러나 형광 현미경 검사 법 마지막 시간 지점에서 microplate 데이터 반영 아트로핀 그룹, 차량 그룹에 비해 낮은 최종 신호 음식 교통 아트로핀 치료 애벌레 (표시 되지 않음)에서 24 시간으로 거의 완료 했다 계시 한다. 반대로, 높은 최종 microplate 형광 차량 취급 애벌레 마지막 시간 지점 하기 전에 그들의 GI로 무효화 분명히 있다 하더라도 전송 시간을 가속 치료와 연관 되었다. 형광 음식을 먹이 하는 애벌레의 치료에 무작위로 할당을 바탕으로, 우리 가정 형광 음식의 동등한 소비 평균 치료 그룹 중. 대변에서 형광 애벌레 기 관에서 소요 된 시간을 감소, 이렇게 및 위에서 설명한 패턴에 따라, 또는 빠른 교통 배설물을 어떻게든 형광을 추가. 그러나 실제 원인은 알 하지 심문, 분석 결과 아직도 이다 측정 하 고 그룹 사이 교통 시간 비교.
작은 분자 화합물에서 독성 기 효과 감지에이 방법의 고용은 하나의 응용 프로그램 이다. 다른 가능한 응용 프로그램 (예를 들어, 과민성 대 장 증후군) 질환 모델링 등 소설 치료 발견 같은 질병, 또는 프로 활동적인 화합물을 발견. 또한, 유전자 변형 모델 결합,이 방법은 사용 될 수가 정상 기 교통, 교통 장애, 장의 신경 결핍 등에서 유전자의 역할. Zebrafish 애벌레 세포 배양의 추정 규모는 전체 유기 체 플랫폼을 제공 하지만 여러 조직과 제 브라에서 함께 작동 하는 무수 한 세포 유형 이후, 시스템 생물학 질문 요청 받을 수 있습니다 및이 사용 하 여 응답 모델입니다.
발전 기술 및 새로운 응용 프로그램으로, zebrafish 독성 테스트의 행위에 효율성 향상을 나갈 것입니다. 방법 및 분석을 처리 하는 애벌레 zebrafish 높은 처리량13,14에서 개선 하기 위해 계속 됩니다. 여기에 제시 된 새로운 방법은 더 강렬한 zebrafish 연구를 만들 수 있는 개선의 한 예입니다.
The authors have nothing to disclose.
Carpetbones.com의 사이먼 카사 르 설계 하 고 만든 기 교통 분석 결과의 생활에서 절차를 설명 하는 데 사용 하는 애니메이션된 그림.
Wild type zebrafish breeding pair | Various sources – for example ZIRC (Zebrafish International Resource Center) | ZL-1 | Adult wild type zebrafish of AB lineage |
1.7-liter Breeding Tank – Beach Style Design | Tecniplast | 1.7L SLOPED | Breeding tank |
Instant Ocean sea salt | Intant Ocean | SS15-10 | Dehydrated sea salt |
First Bites larval fish food | Hikari | 20095 | Powdered larval fish food |
Yellow-green (505/515) Fluospheres | Invitrogen | F8827 | Fluorescent label |
V-bottom 96-well polystyrene microplates | Thermo Fisher Scientific | 249570 | Multiwell microplate with V-shaped bottom in each well |
Atropine | Sigma Aldrich | A0132 | |
Amitriptyline | Sigma Aldrich | A8404 | |
Tegaserod | Sigma Aldrich | SML1504 | |
Metoclopramide | Sigma Aldrich | M0763 | |
Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
Spectramax M2e microplate reader | Molecular Devices | Spectramax M2e | A multi-well plate spectrophotometer capable of fluorescent excitation and emission detection. |
SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | Software for spectrophotometer data acquisition |