טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed
Summary
אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.
Abstract
זה הכרחי לכמת במדויק את מבנים אנטומיים של חומרים תירס מבוסס על טכניקות ניתוח התמונה תפוקה גבוהה. כאן, אנו מספקים “פרוטוקול הכנה מדגם” תירס חומרים (כלומר, גזע, עלים, שורש) מתאים microcomputed רגילים טומוגרפיה (מיקרו-CT) סריקה. על סמך תמונות CT ברזולוציה גבוהה של תירס גזע, עלים, שורש, אנו מתארים שני פרוטוקולים לניתוח פנוטיפי של חבילות עילאיים: (1) על סמך התמונה CT של תירס גזע, עלים, פיתחנו צינור ניתוח תמונה ספציפית באופן אוטומטי לחלץ 31 33 תכונות פנוטיפי של חבילות עילאיים; (2) מבוסס על סדרת תמונות של CT של שורש תירס, אנחנו להגדיר ערכת עיבוד תמונה עבור תלת-ממדי (3-D) חלוקת metaxylem כלי חילוץ דו-ממדית (2-D) ותכונות פנוטיפי תלת-ממדיים, כגון עוצמת, פני שטח של כלי metaxylem, וכו לעומת מדידה ידנית מסורתית של וסקולריים צרורות של חומרים תירס, הפרוטוקולים המוצע באופן משמעותי לשפר את היעילות והדיוק של כימות פנוטיפי בקנה מידה מיקרון.
Introduction
מערכת כלי הדם תירס עובר את הצמח כולו, מן השורש גזע עלים, המהווה את נתיבי תחבורה מרכזיים עבור אספקת מים, חומרים מזינים מינרלים, חומרים אורגניים1. תפקיד חשוב נוסף של מערכת כלי הדם היא לספק תמיכה מכנית של הצמח תירס. לדוגמה, מורפולוגיה, מספר, והפצה של חבילות וסקולריים השורשים, הגבעולים קשורה קשר הדוק ההתנגדות לינה של צמחי תירס2,3. בזמן הנוכחי, מחקרים על המבנה האנטומי של חבילות וסקולריים בעיקר לנצל מיקרוסקופיים וטכניקות ultramicroscopic כדי להציג את מבנה אנטומי של חלק מסויים של גזע, עלים, או שורש, ואז למדוד ואת לספור את המבנים הללו של ריבית על ידי חקירה ידנית. אין ספק, מדידה ידנית של מבנים מיקרוסקופיים שונים ב- microimages בקנה מידה גדול היא עבודה מאוד מייגע ולא יעיל, שמגביל מאד את מידת הדיוק של תכונות microphenotypic, בשל הסובייקטיביות שלה, חוסר עקביות4, 5.
תירס יש אין התפתחות משנית, וכן התוכן מורכב בעיקרו במים meristem הראשי. ללא כל רעלני, טריים דגימות של רקמות תירס ניתן ישירות לסרוק באמצעות מכשיר מיקרו-CT; עם זאת, תוצאות הסריקה הם כנראה עני ומחוספס. הסיבות העיקריות מסוכמים כדלקמן: (1) הנחתה נמוך צפיפות של רקמות הצמח, וכתוצאה מכך ניגוד נמוכה של המספר האטומי ורעש גבוה בתמונות; (2) צמח טרי חומרי נוטים הביתי של הפסיכולוג במהלך הסריקה הסביבה הרגילה, כפי שדווח על ידי Du6. הבעיות הנ ל הפכו האילוצים העיקריים עבור פיתוח, יישום של טכנולוגיה microphenotyping תירס, חיטה, אורז, monocotyledons אחרים. . כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול הכנה דגימה’ כדי pretreat את הדגימות של תירס גזע, עלים, שורש. פרוטוקול זה מונע התייבשות של דפורמציה של הצמח חומרים במהלך ה-CT סריקה; לכן, זה מועיל להגדיל את זמן השימור דוגמאות צמחים עם nondeformation. יתר על כן, הצעד צובעת המבוסס על יוד מוצק גם משפר את החדות של הצמח חומרים; לכן, זה גורם שיפורים משמעותיים באיכות הדמיה של מיקרו-טי יתר על כן, פיתחנו תוכנות עיבוד תמונה, בשם VesselParser, כדי לעבד את התמונות CT של תירס גבעולים ועלים. תוכנה זו משלבת סט צינורות עיבוד תמונה לבצע ניתוח phenotyping תפוקה גבוהה, אוטומטי לתמונות CT דו-ממדי של רקמות שונות. חבילות עילאיים, כל חתך הרוחב של גזע תירס, עלה מזוהים, חילוץ, מזוהה באמצעות שיטת עיבוד תמונה אוטומטי. כתוצאה מכך, אנו משיגים 31 פנוטיפים מיקרוסקופיים של הגזע תירס ו ה33 פנוטיפים מיקרוסקופיים של העלה תירס. עבור הסדרה תמונת CT של השורש תירס, פיתחנו ערכת עיבוד תמונה לרכוש תכונות פנוטיפי תלת-ממדי של כלי metaxylem. ערכה זו עדיפה על היעילות של ייבוא תמונות ושיחזור לעומת שיטות מסורתיות.
תוצאות אלה מציינים כי התמונה עיבוד צינורות בהתחשב שמאפייני מיקרו רנטגן רגילים-CT הדמיה מספקות שיטה יעילה עבור phenotyping מיקרוסקופית של חבילות עילאיים; זה מאוד ומצרה את היישומים של CT טכניקות במדעי הצמח ומשפר את phenotyping אוטומטי של צמח חומרי-רזולוציה הסלולר6,7.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם יישום מוצלח של CT טכנולוגיה בתחומים של וההתערבות, הנדסת חומרים, טכנולוגיה זו בהדרגה נכנס בתחומי בוטניקה וחקלאות, קידום מחקרים בתחום מדעי החיים צמח ככלי טכני מבטיח . בשנות ה-90 המאוחרות, טכנולוגיית CT שימש קודם ללמוד את מבנה מורפולוגי והפיתוח של מערכות השורשים של הצמח. בעשור האחרון, סינכרוט?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי את הלאומי הטבע מדעי היסוד של סין (No.31671577), המדע, הטכנולוגיה חדשנות מיוחד בניה במימון תוכנית בייג’ינג האקדמיה של החקלאות Sciences(KJCX20180423) יערנות, המחקר תוכנית פיתוח של סין (2016YFD0300605-01), קרן מדעי הטבע בייג’ינג (5174033), בייג’ינג פוסט-דוקטורט מחקר קרן (2016 ZZ-66), ואת האקדמיה החקלאית בייג’ינג יערנות מדעי גרנט (KJCX20170404) ( JNKYT201604).
Materials
| Skyscan 1172 X-ray computed tomography system | Bruker Corporation, Belgium | NA | For CT scanning |
| CO2 critical point drying system (Leica CPD300) | Leica Corporation, Germany | NA | For sample drying |
| Ethanol | Any | NA | For FAA fixation |
| Formaldehyde | Any | NA | For FAA fixation |
| Acetic acid | Any | NA | For FAA fixation |
| Surgical blade | Any | NA | For cutting the sample sgements |
| 3D printer | Makerbot replicator 2, MakerBot Industries, USA | NA | For printing the sample baskets of maize root, stem, and leaf |
| Centrifuge tube | Corning, USA | NA | Place the root, stem, or leaf materials |
| Solid iodine | Any | NA | For sample dyeing |
| SkyScan Nrecon software | SkyScan NRecon, Version: 1.6.9.4, Bruker Corporation, Belgium | NA | For image reconstruction |
| VesselParser software | VesselParser, Version: 3.0, National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture (NERCITA), Beijing, China | NA | Image analysis protocol for single CT image of maize stem or leaf |
| ScanIP | ScanIP, Version: 7.0; Simpleware, Exeter, UK | NA | 3D image processing software |
| Latex gloves | Any | NA | |
| Tweezers | Any | NA |
References
- Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
- Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
- Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
- Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
- Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
- Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
- Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
- McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
- Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
- Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
- Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
- Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
- Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
- Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295 (2013).
- Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
- Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673 (2014).
- Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26 (2015).
- Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
- Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655 (2015).
- Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829 (2016).
