Struttura di cristallo del dominio N-terminale del recettore Ryanodine da Plutella xylostella
Summary
In questo articolo, descriviamo i protocolli della determinazione di espressione, purificazione, cristallizzazione e struttura della proteina del dominio N-terminale del recettore rianodinico da diamondback moth (Plutella xylostella).
Abstract
Sviluppo di insetticidi potenti ed efficienti targeting recettori della rianodina insetto (RyRs) è stato di grande interesse nella zona di controllo dei parassiti agricoli. Ad oggi, diversi insetticidi diammide targeting dei parassiti che RyRs sono stati commercializzati, che generano un fatturato annuo di 2 miliardi di dollari. Ma la comprensione del modo di azione degli insetticidi RyR-targeting è limitata dalla mancanza di informazioni strutturali per quanto riguarda insetto RyR. Questo a sua volta limita la comprensione dello sviluppo della resistenza agli insetticidi in parassiti. Il diamondback moth (DBM) è un parassita devastante distruggendo crocifere raccolti in tutto il mondo, che inoltre è stato segnalato per mostrare resistenza agli insetticidi diammide. Pertanto, è di grande importanza pratica per sviluppare nuovi insetticidi il RyR DBM, targeting soprattutto per una regione diversa dal sito di legame tradizionale diammide di targeting. Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare strutturalmente il dominio N-terminale di RyR da DBM. La struttura di cristallo dei raggi x è stato risolto da sostituzione molecolare ad una risoluzione di 2,84 Å, che mostra un motivo di beta-trefoil pieghevole e un accompagnamento alfa elica. Questo protocollo può essere adattato per l’espressione, purificazione e caratterizzazione strutturale di altri domini o proteine in generale.
Introduction
Recettori della rianodina (RyRs) sono canali ionici specifici, che mediano la permeazione degli ioni Ca2 + attraverso le membrane del reticolo sarcoplasmatico (SR) nelle cellule muscolari. Di conseguenza, giocano un ruolo importante nel processo di accoppiamento eccitazione contrazione. Nella sua forma funzionale, RyR monta come un homo-tetramero con una massa molecolare di > 2 MDa, con ogni unità secondaria che contengono residui dell’amminoacido ~ 5000. Nei mammiferi, ci sono tre isoforme: RyR1 – tipo di muscolo scheletrico, muscolo cardiaco tipo di RyR2 – e RyR3-ubiquitariamente espressa in diversi tessuti1.
Negli insetti c’è un solo tipo di RyR, che si esprime nel tessuto muscolare e nervoso2. Insetto RyR è più simile a mammiferi RyR2 con un’identità di sequenza di circa il 47%3. Insetticidi di diammide targeting RyR di lepidotteri e coleotteri sono stati sviluppati e commercializzati da importanti aziende come Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Dal suo lancio relativamente recente, diammide insetticidi sono diventati uno della più rapida crescita classe di insetticidi. Attualmente, le vendite di questi tre insetticidi annualmente hanno attraversato 2 miliardi di dollari con un tasso di crescita di oltre il 50% dal 2009 (Agranova).
Gli studi recenti hanno segnalato lo sviluppo di resistenza negli insetti dopo poche generazioni di utilizzo di questi insetticidi4,5,6,7,8. Le mutazioni di resistenza nel dominio del transmembrane di RyRs dal diamondback moth (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) e le corrispondenti posizioni in pomodoro minatrice, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostrano che la regione potrebbe essere coinvolto nel legame di insetticida diammide come questa regione è conosciuta per essere critico per gating del canale4,8,9. Nonostante approfondite ricerche in questo settore, i meccanismi molecolari esatti di insetticidi diammide rimangono evasivi. Inoltre, non è chiaro se le mutazioni di resistenza riguardano le interazioni con diamides direttamente o allosterico.
Precedenti studi hanno segnalato la struttura dei diversi domini di RyR da specie di mammiferi e la struttura del full-length dei mammiferi RyR1 e RyR2 di cristallografia a raggi x e microscopia crio-elettronica, rispettivamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Ma finora, nessuna struttura di insetto RyR è stata segnalata, che ci impedisce di comprendere le complessità molecolare della funzione del ricevitore come pure i meccanismi molecolari di azione insetticida e lo sviluppo della resistenza agli insetticidi.
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo generalizzato per la caratterizzazione strutturale del dominio β-trifoglio N-terminale del recettore rianodinico dal diamondback moth, un parassita distruttivo infettare crocifere colture in tutto il mondo22. Il costrutto è stato progettato secondo il coniglio pubblicati RyR1 NTD cristallo strutture23,24e cryo-EM modelli strutturali16,17,18,19, 20 , 21. Questa è la prima struttura ad alta risoluzione segnalata per insetto RyR, che rivela il meccanismo per canale gating e fornisce un modello importante per lo sviluppo di specie-insetticidi utilizzando Progettazione di farmaci basati su struttura. Per delucidazione della struttura, abbiamo impiegato la cristallografia a raggi x, che è considerato come il ‘gold standard’ per la determinazione della struttura della proteina a vicino a risoluzione atomica. Anche se il processo di cristallizzazione è imprevedibile e alta intensità di manodopera, questo protocollo passo-passo vi aiuterà i ricercatori di esprimere, purificare e caratterizzare altri domini di insetto RyR o qualsiasi altre proteine in generale.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, descriviamo la procedura per recombinantly esprimere, purificare, cristallizzare e determinare la struttura di DBM RyR NTD. Per cristallizzazione, un requisito fondamentale è quello di ottenere proteine con omogeneità, purezza e solubilità alta. Nel nostro protocollo, abbiamo scelto di utilizzare animali-28a-HMT vettoriale in quanto contiene un tag hexahistidine e MBP, entrambi i quali potrebbero essere utilizzati per la purificazione ottenere una maggiore purezza di piega. Inoltre, gli aiuti di ta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamenti per questa ricerca è stata fornita da: nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), National Nature Science Foundation of China (31320103922, 31230061) e programma di progetto di ricerca base nazionale (973) di Cina (2015CB856500, 2015CB856504). Siamo grati al personale la beamline BL17U1 a Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
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