Structure cristalline du domaine N-terminal du récepteur à la Ryanodine de Plutella xylostella
Summary
Dans cet article, nous décrivons les protocoles de détermination d’expression, purification, la cristallisation et la structure de la protéine du domaine N-terminal du récepteur à la ryanodine de teigne des crucifères (Plutella xylostella).
Abstract
Développement des insecticides puissants et efficaces ciblant les récepteurs de la ryanodine insectes (RyRs) a été d’un grand intérêt dans le domaine de la lutte contre les parasites agricoles. A ce jour, plusieurs diamide insecticides ciblant les ravageurs que ryrs ont été commercialisés, qui génèrent un revenu annuel de 2 milliards de dollars US. Mais la compréhension du mode d’action des insecticides RyR ciblage est limitée par le manque d’informations structurelles concernant les insectes RyR. Ceci limite à leur tour comprendre le développement de la résistance aux insecticides de ravageurs. La teigne des crucifères (DBM) est un ravageur dévastatrice, détruisant les crucifères cultivées dans le monde entier, qui a également été signalé à montrer aux diamide insecticides. Par conséquent, il est d’une grande importance pratique pour développer de nouveaux insecticides ciblant le RyR DBM, ciblant plus particulièrement une région différente de l’accepteur diamide traditionnels. Nous présentons ici un protocole afin de caractériser structurellement le domaine N-terminal de RyR de DBM. La structure cristalline a été résolue par le remplacement moléculaire à une résolution de 2,84 Å, qui montre un motif de bêta-trefoil pliable et une accompagnement hélice alpha. Ce protocole peut être adapté pour l’expression, de purification et de caractérisation structurale des autres domaines ou des protéines en général.
Introduction
Récepteurs de la ryanodine (RyRs) sont des canaux ioniques spécifiques qui négocient la pénétration des ions Ca2 + à travers les membranes du réticulum sarcoplasmique (RS) dans les cellules musculaires. Par conséquent, ils jouent un rôle important dans l’excitation contraction processus de couplage. Dans sa forme fonctionnelle, RyR assemble comme un homo-tétramère ayant une masse moléculaire de > 2 MDa, avec chaque sous-unité comportant des résidus d’acides aminés ~ 5000. Chez les mammifères, il existe trois isoformes : RyR1 – type de muscle squelettique, le muscle cardiaque type de RyR2 – et RyR3-ubiquitaire exprimés dans différents tissus1.
Chez les insectes, il y a qu’un seul type de RyR, qui s’exprime dans le tissu musculaire et nerveuse2. RyR insecte est plus proche de mammifères RyR2 avec une identité de séquence d’environ 47 %3. Diamide insecticides ciblant RyR de lépidoptères et coléoptères ont été développés et commercialisés par grandes entreprises telles que Bayer (flubendiamide), DuPont (chlorantraniliprole) et Syngenta (cyantraniliprole). Depuis sa création relativement récente, diamide insecticides sont devenus un de la classe plus forte croissance d’insecticides. Actuellement, les ventes de ces trois insecticides par an ont franchi les 2 milliards de dollars avec un taux de croissance de plus de 50 % depuis 2009 (Agranova).
Des études récentes ont signalé l’apparition d’une résistance chez les insectes après quelques générations d’utilisation de ces insecticides4,5,6,7,8. Les mutations de résistance dans le domaine transmembranaire de RyRs de la teigne des crucifères (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) et aux emplacements correspondants à la mineuse de la tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) montrent que la région pourraient être impliqués dans la liaison de diamide insecticides comme cette région est connue pour être critique pour le processus de blocage du canal4,8,9. Malgré des recherches approfondies dans ce domaine, les mécanismes moléculaires exacts de diamide insecticides demeurent insaisissables. En outre, on ignore si les mutations de résistance influent sur les interactions avec les diamides directement ou de façon allostérique.
Des études antérieures ont révélé la structure de plusieurs domaines de RyR d’espèces de mammifères et la structure de RyR1 mammifères pleine longueur et RyR2 par cristallographie aux rayons x et microscopie de cryo-électronique, respectivement10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Mais jusqu’ici, aucune structure d’insecte RyR n’a été signalée, qui nous interdit de saisir la complexité moléculaire de la fonction des récepteurs ainsi que les mécanismes moléculaires d’action insecticide et le développement de la résistance aux insecticides.
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole généralisé pour la caractérisation du domaine β-trefoil N-terminale du récepteur à la ryanodine de la teigne des crucifères, un ravageur qui infectent les crucifères cultivées dans le monde entier22. La construction a été conçue selon le lapin publiées RyR1 NTD crystal structures23,24et la cryo-EM modèles structuraux16,17,18,19, 20 , 21. il s’agit de la première structure à haute résolution pour insecte RyR, qui révèle le mécanisme de blocage du canal et fournit un modèle important pour le développement des insecticides spécifiques à l’aide de conception de médicaments basée sur la structure. Pour l’élucidation de la structure, nous avons utilisé la cristallographie aux rayons x, qui est considérée comme le « gold standard » pour la détermination de structure de protéine à près de résolution atomique. Bien que le processus de cristallisation est imprévisible et demande beaucoup de travail, le présent protocole étape par étape aidera les chercheurs à exprimer, de purifier et de caractériser les autres domaines d’insecte RyR ou tout autres protéines en général.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous décrivons la procédure pour l’inoculation express, purifier, cristalliser et déterminer la structure de DBM RyR NTD. De cristallisation, une condition essentielle est d’obtenir des protéines avec l’homogénéité, la pureté et la solubilité élevée. Dans notre protocole, nous avons choisi d’utiliser TEP-28 a-HMT vecteur car il contient une protéine balise et la balise MBP, qui pourraient être utilisés pour la purification obtenir une pureté supérieure de pli. En outre, le MBP ta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de cette recherche a été fournie par : National Key Research et Development Programme of China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), Nature Science Fondation nationale de Chine (31320103922, 31230061) et projet de recherche fondamentale National (973) programme de Chine (2015CB856500, 2015CB856504). Nous sommes reconnaissants envers le personnel sur la ligne de faisceau BL17U1 à Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
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