מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella
Summary
במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים של נחישות ביטוי, טיהור, התגבשות ומבנה חלבון של התחום N-מסוף של קולטן ryanodine מ- diamondback עש (Plutella xylostella).
Abstract
פיתוח חומרי הדברה חזק ויעיל מיקוד קולטנים ryanodine חרקים (RyRs) היה עניין רב בתחום הדברה חקלאיים. נכון להיום, מספר קוטלי חרקים diamide מיקוד המזיק שחייב להיות ממוסחר RyRs, אשר מפיקים הכנסות שנתיות של 2 מיליארד דולר. אבל הבנה של מצב הפעולה של פילוח RyR קוטלי חרקים הוא מוגבל על ידי חוסר של מבני מידע לגבי חרקים RyR. זה בתורו מגבילה את ההבנה של ההתפתחות של עמידות חרקים מזיקים. העש diamondback (DBM) הוא נודניק הרסנית השמדת יבולים המצליבים ברחבי העולם, אשר דווחה גם להראות התנגדות הדברה diamide. לכן חשיבות מעשית רבה לפתח הדברה חדשניים מיקוד RyR DBM, במיוחד לעבר אזור שונים מתוך אתר איגוד diamide המסורתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיין מבחינה מבנית המחשבים N-מסוף של RyR מ DBM. המבנה נפתרה על-ידי החלפת מולקולרית ברזולוציה של 2.84, אשר מציגה את מוטיב מתקפלים בטא-trefoil, סליל אלפא איגוף. פרוטוקול זה ניתן להתאים את הביטוי, טיהור, אפיון מבניים של קבוצות מחשבים או חלבונים אחרים באופן כללי.
Introduction
קולטנים Ryanodine (RyRs) הם תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים, אשר לתווך על הסתננות של Ca2 + יונים על-פני הממברנות sarcoplasmic רשת (SR) בתאי השריר. לכן, הם לשחק תפקיד חשוב להתכווצות עירור צימוד תהליך. בצורתו פונקציונלי, RyR מרכיב כמו הומו-tetramer עם מסה מולקולרית של > מד א 2, עם כל יחידה משנית הכוללת של שאריות חומצה אמינית ~ 5000. ביונקים, ישנם שלושה איזופורמים: RyR1 מסוג שרירי השלד, שריר הלב סוג RyR2 – ו RyR3-ubiquitously לידי ביטוי ברקמות שונות1.
חרקים יש רק סוג אחד של RyR, הבאה לידי ביטוי רקמות שרירים, עצבים2. RyR חרקים הוא דומה יותר RyR2 בתרבית של זהות רצף כ- 47%3. הדברה Diamide מיקוד RyR של פרפראים הזבוביים וקשיי יש כבר פותחו ומשווקים על ידי חברות גדולות כמו באייר (flubendiamide), דופונט (chlorantraniliprole) והפריבט (cyantraniliprole). מאז השקתה יחסית לאחרונה, הדברה diamide הפכו להיות אחד של המעמד הצמיחה המהירה של קוטלי חרקים. נכון לעכשיו, המכירות של אלה של שלושה קוטלי חרקים מדי שנה חצו 2 מיליארד דולר ארה עם קצב גידול של למעלה מ-50% מאז 2009 (Agranova).
מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של עמידות חרקים לאחר כמה דורות של השימוש האלה קוטלי חרקים4,5,–6,–7,–8. ההתנגדות מוטציות בתחום transmembrane של RyRs העש diamondback (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M), את עמדות המקביל האילוח עגבניות, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) מראים כי האזור יכול להיות מעורב diamide קוטל חרקים מחייב כמו אזור זה ידוע להיות קריטי עבור gating של ערוץ4,8,9. למרות מחקר מקיף בתחום זה, המנגנונים המולקולריים המדויק של קוטלי חרקים diamide נשארים חמקמקים. יתר על כן, לא ברור מוטציות עמידות להשפיע את האינטראקציות עם diamides ישירות או allosterically.
מחקרים מוקדמים יותר דיווחו על המבנה של מספר תחומים RyR של יונקים ואת המבנה של RyR1 יונקים באורך מלא, RyR2 על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ואלקטרון הקפאה-, בהתאמה10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . אבל עד כה, אין מבנה של חרק RyR דווחה, אשר אוסרת עלינו. הבנת המורכבות מולקולרית של הפונקציה קולטן וכן את המנגנונים המולקולריים של פעולה בקוטלי חרקים, התפתחות של עמידות חרקים.
כתב יד זה, אנו מציגים עבור אפיון מבניים N-מסוף תחום β-trefoil של קולטן ryanodine מ- diamondback העש, נודניק הרסני מדביק המצליבים יבולים ברחבי העולם22פרוטוקול מוכללת. הבונה עוצבה בהתאם את הארנב שפורסם RyR1 NTD קריסטל מבנים23,24ו של הקפאה-EM מודלים מבניים16,17,18,19, 20 , 21. זה המבנה ברזולוציה גבוהה הראשון שדווחו עבור חרקים RyR, אשר חושף את המנגנון עבור ערוץ gating מספק תבנית חשוב לפיתוח חומרי הדברה תלויי מין באמצעות עיצוב מבוסס על מבנה סמים. עבור מבנה הבהרה, אנחנו מועסקים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, אשר נחשב “תקן הזהב’ לקביעת מבנה החלבון-ליד ברזולוציה אטומית. למרות תהליך התגבשות הוא צפוי ועבודה אינטנסיבית, פרוטוקול שלב אחר שלב זה תסייע לחוקרים אקספרס, לטהר ולאפיין תחומים אחרים של חרק RyR או כל לחלבונים אחרים באופן כללי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בנייר זה, אנו מתארים את ההליך כדי recombinantly express, לטהר, מתגבשים, לקבוע את המבנה של DBM RyR NTD. על התגבשות, דרישה חיונית הוא לקבל חלבונים עם מסיסות גבוהה, טוהר, הומוגניות. בפרוטוקול שלנו, בחרנו להשתמש וקטור pET-28a-HMT כפי שהוא מכיל hexahistidine תג ותג MBP, אשר שניהם יכול להיות מנוצל עבור טיהור להשיג טוהר קיפול גב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון עבור מחקר זה נמסר על ידי: המחקר מפתח הלאומי, פיתוח תוכנית של סין (2017YFD0201400, 2017YFD0201403) הלאומי הטבע מדעי היסוד של סין (31320103922, 31230061), תוכנית פרוייקט של נבחרת מחקר בסיסי (973) סין (2015CB856500, 2015CB856504). אנחנו אסירי תודה לצוות על הפרעות לקרן החלקיקים BL17U1-מתקן קרינה סינכרוטרון שנגחאי (SSRF)
Materials
| pET-28a-HMT vector | This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009) | ||
| E. coli BL21 (DE3) strain | Novagen | 69450-3CN | |
| HisTrapHP column (5 mL) | GE Healthcare | 45-000-325 | |
| Amylose resin column | New England Biolabs | E8021S | |
| Q Sepharose high-performance column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Amicon concentrators (10 kDa MWCO) | Millipore | UFC901008 | |
| Superdex 200 26/600 gel-filtration column | GE Healthcare | 28-9893-36 | |
| Automated liquid handling robotic system | Art Robbins Instruments | Gryphon | |
| 96 Well CrystalQuick | Greiner bio-one | 82050-494 | |
| Uni-Puck | Molecular Dimensions | MD7-601 | |
| Mounted CryoLoop – 20 micron | Hampton Research | HR4-955 | |
| CryoWand | Molecular Dimensions | MD7-411 | |
| Puck dewar loading tool | Molecular Dimensions | MD7-607 | |
| Nano drop | Thermo Scientific | NanoDrop One | |
| Crystal incubator | Molecular Dimensions | MD5-605 | |
| X-Ray diffractor | Rigaku | FRX | |
| PCR machine | Eppendorf | Nexus GX2 | |
| Plasmid mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| SspI restriction endonuclease | NEB | R0132S | |
| T4 DNA polymerase | Novagen | 2868713 | |
| Kanamycin | Scientific Chemical | 25389940 | |
| IPTG | Genview | 367931 | |
| HEPES | Genview | 7365459 | |
| β-mercaptoethanol | Genview | 60242 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall LYNX 6000 | |
| Sonnicator | Scientz | II-D | |
| Protein purification system | GE Healthcare | Akta Pure | |
| Light microscope | Nikon | SMZ745 | |
| IzIt crystal dye | Hampton Research | HR4-710 | |
| Electrophoresis unit | Bio-Rad | 1658005EDU | |
| Shaker Incubator | Zhicheng | ZWYR-D2401 | |
| Index crystal screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| Structure crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-01 | |
| ProPlex crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-38 | |
| PACT premier crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-29 | |
| JCSG-plus crystal screen | Molecular Dimensions | MD1-37 |
References
- Giannini, G., Sorrentino, V. Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels. Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).
- Takeshima, H., et al. Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster. FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).
- Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals. Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).
- Steinbach, D., et al. Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).
- Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China. Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).
- Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae). Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).
- Guo, L., et al. Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole. Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).
- Troczka, B., et al. Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).
- Roditakis, E., et al. Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).
- Borko, L., et al. Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias. Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).
- Sharma, P., et al. Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor. FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).
- Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface. Nature Communications. 4, 1506 (2013).
- Lau, K., Van Petegem, F. Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain. Nature Communications. 5, 5397 (2014).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- des Georges, A., et al. Structural Basis for Gating and Activation of RyR1. Cell. 167 (1), 145-157 (2016).
- Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).
- Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2. Science. 354 (6310), (2016).
- Wei, R. S., et al. Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1. Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).
- Yan, Z., et al. Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution. Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects. Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).
- Amador, F. J., et al. Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation "hot spot" loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).
- Lobo, P. A., Van Petegem, F. Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations. Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Stepanov, S., et al. JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).
- Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution–from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation. CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).
- Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Lin, L., et al. Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).
- Qi, S., Casida, J. E. Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).
